Etude des mécanismes moléculaires de la phagocytose dans les macrophages et de sa perturbation par le VIH-1
Institution:
Paris 5Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Phagocytosis is a mechanism of internalization of microorganisms and debris that leads to the formation of an intracellular vacuole larger than 0. 5 microns. This mechanism is initiated by the activation of receptors on the surface of professional phagocytes such as macrophages and depends on an intense actin polymerization and reorganization of the plasma membrane involving exocytosis from intracellular compartments. Recycling endosomes bearing AP1, VAMPS and TNFa, and a subpopulation of late endosomes bearing VAMP7, participate in the exocytosis. We investigated the respective locations of the polymerized actin and vesicular compartments, by evanescent wave microscopy. We used the "frustrated phagocytosis" system where cells try to "phagocyte to infinity" and spread on the ligands of phagocytic receptors, as well as a new system that we developed to study the step of phagosome closure. According to our observations, F-actin accumulates in the cell periphery and in the tips of pseudopodia while actin depolymerizes in the center of the phagocytic cup, where vesicular trafficking is more active. This model is to be completed to clarify the molecular players involved in the different stages of progression and closure of phagosomes. The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infects macrophages, which causes a déficience of phagocytosis of thèse cells. One of thé major virulence factors of HIV-1 is thé Nef (négative factor) protein, known to disrupt thé organization of thé actin cytoskeleton and subcellular trafficking. We observed that infection with HIV-1, and expression of Nef in particular, inhibits phagocytosis by différent receptors in macrophages. Nef protein significantly alters thé recruitment at thé phagocytic cup of recycling endosomes bearing AP1, VAMPS and TNFa. In contrast, Nef does not interfère with thé accumulation of VAMP7 nor that of F-actin. To inhibit phagocytosis Nef requires its myristoylation site and thé LL, DD and PXXP motifs. Finally, we found that Nef interacts with thé AP1 motif via thé LL motif, probably leading to thé disruption of membrane reorganization required for efficient phagocytosis, whereas actin is not altered. My thesis work helped bring new éléments on thé cellular and molecular mechanisms of phagocytosis and to better understand thé dysfunctions observed in macrophages of HIV-1-infected patients.
Abstract FR:
La phagocytose est un mode d'internalisation de microorganismes et de débris qui conduit à la formation d'une vacuole intracellulaire de taille supérieure à 0,5 microns. Ce mécanisme est initié par l'activation de récepteurs présents à la surface des phagocytes professionnels comme les macrophages et dépend d'une intense polymérisation d'actine et d'une réorganisation de la membrane plasmique faisant intervenir une exocytose à partir de compartiments intracellulaires. Les endosomes de recyclages marqués par AP1, VAMPS et le TNFa, ainsi qu'une sous-population d'endosomes tardifs marqués par VAMP7, participent à cette exocytose. Nous avons étudié les localisations respectives de l'actine polymérisée et des ompartiments vésiculaires, par microscopie à onde évanescente. Nous avons utilisé un système de phagocytose frustrée où la cellule « phagocyte à l'infini » et s'étale sur des ligands des récepteurs phagocytaires, ainsi qu'un nouveau système que nous avons développé pour étudier la fermeture des phagosomes. D'après nos observations, l'actine-F s'accumule en périphérie de la cellule et dans les extrémités des pseudopodes alors que l'actine se dépolymérise au centre et dans la coupe phagocytaire, lieu où le trafic vésiculaire est plus actif. Ce modèle est à compléter pour préciser les acteurs moléculaires impliqués dans les étapes de progression et de fermeture des phagosomes. Le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) infecte les macrophages, ce qui provoque une déficience de phagocytose de ces cellules. Un des facteurs de virulence majeur du VIH-1 est la protéine Nef (Facteur négatif) connue pour perturber l'organisation du cytosquelette d'actine ainsi que le trafic subcellulaire. Nous avons observé que l'infection par le VIH-1 et l'expression de Nef en particulier inhibe la phagocytose par divers récepteurs des macrophages. La protéine Nef altère fortement le recrutement à la coupe phagocytaire des endosomes de recyclage porteurs d'AP1, de VAMPS et du TNFa. À contrario, Nef ne perturbe pas l'accumulation de VAMP7 ni celui de l'actine-F. Pour inhiber la phagocytose Nef requiert son site de myristylation et ses motifs LL, DD et PXXP. Enfin, nous avons constaté que Nef interagit avec AP1 via son motif LL, ce qui conduit sans doute à la perturbation des réorganisations membranaires nécessaires pour une phagocytose efficace, alors que l'actine n'est pas altérée. Mon travail de thèse a permis d'apporter des éléments nouveaux sur les mécanismes cellulaires et moléculaires de la phagocytose et de mieux comprendre les dysfonctionnements observés chez les macrophages de patients infectés par le VIH.