Implication du gène GFAP dans les pathologies humaines neurodégénératives de la substance blanche
Institution:
Clermont-Ferrand 1Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Among genetic diseases involving the cerebral white matter or leukodystrophies, Alexander disease is characterized by an accumulation in astrocytes of diffuse eosinophilic cytoplasmic inclusions named Rosenthal fibers, with demyelination. The clinical spectrum and radiological characteristics of this disease are wider than initially described for early forms, adult forms being particularly heterogeneous. We have developed a diagnostic method, fast and inexpensive, based on DHPLC analysis of PCR products allowing the screening of GFAP mutations in a significant number of patients. We analyzed 42 families suspected of Alexander disease and identified 15 heterozygous missense mutations in 17 patients, 8 of which have never been described. The study of a large number of later forms led to redefine diagnostic criteria of juvenile and adult forms. Among our cohort of patients, 60% displayed no mutation of GFAP while clinical and radiological features of most of them do not differ from those of mutated patients. We have suspected the involvement of other GFAP molecular defects leading to overexpression : a copy number variation or a mutation in regulatory sequences. We analysed by QMPSF 177 patients affected by Alexander disease or undetermined leukodystrophy and identified neither duplication nor deletion of the 9 coding regions of GFAPα. We analysed by sequencing a 5'genomic region of GFAP in 58 patients displaying a phenotype consistent with Alexander disease and identified a total of 7 substitutions which functional consequences on transcription were tested in astrocytoma cells. Finally, 2 substitutions -1279C>T and 1313G>C reduced the in vitro transcriptional activity of the promoter. Finally we analyzed the specific coding sequences of 2 alternative isoforms GFAP ε and κ in 58 patients suspected of Alexander disease and identified a total of 8 variations including 2 amino acid substitutions : εp. Arg430Cys and εp. Arg430His. Functional tests in astroglioma cells have not provided arguments in favor of an intermediate filament disruption by direct interaction between these mutants and GFAPα. In conclusion we developed a molecular method for Alexander disease diagnostic suited for later forms analysis. We have excluded gene rearrangements as causative or aggravating factor and we do not obtained arguments in favor of GFAP ε and κ involvement. Two substitutions in the promoter sequence clearly reduce the in vitro transcriptional activity of this region. We have to confirm this inhibitory effect in vivo and demonstrate that the reduced expression is associated with Alexander phenotype.
Abstract FR:
Parmi les maladies génétiques affectant la substance blanche du système nerveux ou leucodystrophies, la maladie d'Alexander est caractérisée par une accumulation diffuse dans les astrocytes d'inclusions cytoplasmiques éosinophiles, les fibres de Rosenthal, accompagnée d'une démyélinisation. Il est clairement établi que le spectre clinique et les caractéristiques radiologiques de cette pathologie sont plus vastes que décrit initialement pour les formes précoces, les formes adultes étant particulièrement hétérogènes. Nous avons développé une méthode diagnostique, rapide et peu onéreuse, basée sur l'analyse par DHPLC des produits d'amplification, adapté à l'analyse des formes tardives, atypiques voir asymptomatiques. A partir d'une cohorte de 42 familles, nous avons identifié 15 mutations hétérozygotes faux-sens et redéfini les critères diagnostiques des formes juvéniles et adultes. Aucune mutation de GFAP n'a été détectée chez 60% des patients. Nous avons suspecté l'implication d'autres défauts moléculaires de GFAP pouvant conduire à une surexpression : un réarrangement génique ou une variation dans des séquences régulatrices. La recherche de réarrangements géniques par QMPSF n'a permis d'identifier chez 177 patients atteints de maladie d'alexander ou de leucodystrophie de cause indéterminée ni délétion ni duplication de GFAP. Le séquençage d'une région génomique 5'flanquante de GFAP chez 58 patients présentant un phénotype compatible avec la maladie d'Alexander a mis en évidence 7 substitutions dont les conséquences fonctionnelles sur la transcription ont été testées en ligne astrocytaire. Au final, 2 variations -1279C>T et -1313G>C réduisent in vitro l'activité transcriptionnelle. Il sera nécessaire de confirmer cet effet inhibiteur in vivo puis de démontrer que cette réduction d'expression est liée à un phénotype d'Alexander. Lors de l'analyse des séquences codantes spécifiques des 2 isoformes minoritaires GFAPε et κ, nous avons mis en évidence chez 58 patients suspectés de maladie d'Alexander 8 variations dont 2 substitutions d'acide aminé : εp. Arg430Cys et εp. Arg430His. Les premiers tests fonctionnels en lignée astrocytaire ne nous ont pas apporté d'arguments en faveur d'une perturbation du réseau de filaments intermédiaires par interaction directe avec GFAPα.