Abstract FR:

Le reverse dot est une methode appliquee a la detection simultanee de plusieurs sequences cibles par hybridation avec des sondes immobilisees sur un support. Nous proposons pour cela deux systemes de fixation covalente: immobilisation d'oligonucleotides 4-hydroxyphenyles sur des feuilles de cellulose diazotee et couplage des oligonucleotides amines sur des membranes de nylon fonctionnalise par de la polyethyleneimine. Pour les deux systemes, la fixation est stable et la capacite d'immobilisation est comparable a celle des autres methodes decrites. La selectivite pour le groupe phenol est superieure a 90% pour la cellulose diazotee alors qu'une fixation parasite par les nucleobases de 30% est observee pour le nylon. Une optimisation du procede sur nylon peut etre facilement envisagee. Les deux systemes ont ete testes pour la detection par hybridation des sequences des papillomavirus de type 16 et 6/11 amplifies par pcr. Une amorce fixee sur la cellulose permet d'effectuer l'amplification et la detection sur le meme support. Des phosphoramidites nucleosidiques et non nucleosidiques (derives de l'hexane-1,2,6-triol) ont ete prepares pour la fonctionnalisation des oligonucleotides par un groupe 4-hydroxyphenyle. Ces oligonucleotides modifies peuvent aussi etre utilises pour le marquage avec de l'iode 125 de sondes de detection. Ils peuvent, de plus, etre phosphoryles enzymatiquement: cela met en evidence la reconnaissance par la polynucleotide kinase du phage t#4 du groupe hydroxyle primaire de residus non-nucleosidiques portes en 5' d'un oligonucleotide. Plusieurs composes modeles, chiraux et achiraux, bases sur des motifs 1,2 et 1,3 diols ont ete etudies comme substrats. Nous avons montres que la phosphorylation est stereoselective pour les residus 1,2 diols