Caractérisation moléculaire et mécanisme d'action de la pullulanase type II (TH-Apu-Delta2) isolée chez l'archaeum hyperthermophile "Thermococcus Hydrothermalis"
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Abstract EN:
The industrial demands for new biotechnological tools expecially thermostables enzymes has previously led to the isolation of several glycosyl-hydrolases from the hyperthermophilic archaea "Thermococcus hydrothermalis", one of which was a pullulanase type II. The identification and sequencing of the gene encoding this enzyme has allowed the DNA encoding the catalytic domain to be cloned and expressed in "E. Coli". This domain designated Th-ApuD2, codes for a 88469 Da protein composed of 770 amino-acids. Like other pullulanases type II, Th-ApuD2 is able to hydrolyse both a-(1,6) likages in pullulan and a-(1,4) likages in amylose. The enzyme belongs to the glycosyl-hydrolase family 57, a poorly studied family for which no structural data is available. In this study, in order to investigate Th-ApuD2 bi-functionnality and to increase our general knowledge of family GH57 enzymes, we have performed a delaited biochemical characterization of Th-ApuD2. The study of substrat specificity and mode of action has allowed Th-ApuD2 to be classified as an exo-acting enzyme which degrades both pullulan and amylose from the reducing end. In addition, the identification of the inhibition modes of different molecules and the determination of the kinetic parameters of reactions involving a wide range of substrates have not only shown that a single active is responsible for both hydrolytic activities, but have facilitated the elaboration of a shematic model for the organisation of this site. With regard to the dual hydrolic activitiesof Th-ApuD2, mutagenesis experiments based on the sequence comparison with other proteins, including those from GH57, revealed the importance of three acidic residues (E291, D313 and D394). The absence of detectable activity in the presence of either pullulan or amylose suggest that E291 and D394 are essential for the catalytic mecanism
Abstract FR:
Les besoins de l'industrie en nouveaux outils biotechnologiques, notamment des enzymes thermostables, ont conduit précédemment à l'isolement chez une " archaea " hyperthermophile " Thermococcus hydrothermalis " de plusieurs glycosyl-hydrolases, dont une pullulanase type II. L'identification et le séquençage du gène codant pour cette dernière a abouti au clonage et à l'expression du domaine catalytique de l'enzyme chez " E. Coli ". Ce domaine, désigné Th-ApuD2, correspond à une protéine de 88469 Da, composée de 770 acides aminés. Comme toute pullulanase type II, Th-ApuD2 est capable d'hydrolyser aussi bien les liaisons a-(1,6) du pullulane que les liaisons a-(1,4) de l'amylose. Par ailleurs, elle appartient à la famille 57 des glycosyl-hydrolases, une famille pour laquelle il existe très peu d'informations et aucune description de structure tridimentionnelle. Dans la présente étude, de manière à élucider les bases de la bi-fonctionnalité de Th-ApuD2 et d'enrichir les connaissances des enzymes de la famille GH57, une caractérisation biochimique approfondie a été conduite. L'étude de la spécificité de substrat et du mode ont permis de décrire Th-ApuD2 comme une exo-enzyme qui dégrade le pullulane ou l'amylose par l'extrémité réductrice. De plus, la caractérisation des modes d'inhibition de différentes molécules ainsi que la détermination des paramètres cinétiques d'hydrolyse d'une gamme variée de substrats ont conduit non seulement à prouver l'existence d'un site actif unique, responsable des deux activités hydrolytiques, mais aussi à proposer un modèle d'organisation de ce dernier. En ce qui concerne les deux activités hydroliques de Th-ApuD2, des expériences de mutagène basées sur la comparaison de la séquence de Th-ApuD2 avec d'autres protéines notamment des enzymes de la famille GH57, ont mis en évidence l'importance de trois résidus acides (E291, D313 et D394). L'absence d'activité mesurable des mutants Th-ApuD2-E291A et Th-ApuD2-D394A sur pullulane et amylose indique que ces deux résidus jouent des rôles essentiels dans le mécanisme catalytique.