Définition des critères d'efficacité d'une hémicellulase pour l'hydrolyse de substrats lignocellulosiques complexes et insolubles
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The development of enzymatic technologies offers an alternative, environmentally-friendly interesting strategy for controlled fractionation and upgrading of lignocellulosic biomass (biofuels, biopolymers, industrially-relevant chemicals. . . ). The effectiveness of these biocatalysts is, nevertheless, limited by multiple factors related to their structural and functional characteristics, but also to the complex nature of the lignocellulosic biomass (rich in lignified secondary cell walls). In order to identify the key parameters for an effective bioconversion of hemicelluloses, the major components of lignocelluloses, we have focused our study on the endoxylanase (Tx-Xyl) of Thermobacillus xylanilyticus, a family 11 glycoside- hydrolase (GH11). In a biomimetic approach, we have studied the action pattern of Tx-Xyl on different substrates displaying increasing complexity (isolated heteroxylans, in vitro reconstituted copolymer assemblies. . . ). The use of nano-composites of heteroxylans - lignins (DHPs) synthesized in vitro has enabled us to reveal that supramolecular organization of the covalent complexes (LCC) would severely hamper the enzyme's access to carbohydrates. Otherwise, a direct correlation has been established between the increase in the lignin content of the nano-composites and the decrease of the enzyme activity suggesting direct nonspecific lignins-enzyme interactions. In addition, the study of the interactions of Tx-Xyl with various hydroxycinamic acids (p-coumaric, ferulic, caffeic acids. . . ) has revealed a non-competitive inhibition of the enzyme by these phenolic compounds. Using protein engineering, we have developed a strategy which aims at modifying the Tx-Xyl architecture and/or specificity by grafting, through "linker" sequences, different protein modules: the CBM1 of the cellulase Cel7A from Trichoderma reesei binding specifically crystalline cellulose and the GFP (Green Fluoerescent Protein). The chimeric fusion proteins Tx-Xyl-CBM1 and Tx-Xyl-GFP obtained have been less effective on soluble xylans (low kcat) than Tx-Xyl. However, their efficiency on lignocellulosic substrates (such as wheat by products; straw and bran) was different. Indeed, modestly enhanced hydrolysis rates were obtained in the case of Tx-Xyl-CBM1, suggesting that the CBM1 may potentiate in situ action of the enzyme, contrary to Tx-Xyl-GFP whose size would be a factor limiting its diffusion/action within the cell wall network
Abstract FR:
Le développement de technologies enzymatiques constitue un enjeu majeur pour le fractionnement maîtrisé et la valorisation des ressources lignocellulosiques (biocarburants, biopolymères, synthons…). L’efficacité de ces biocatalyseurs est cependant limitée par de multiples facteurs liés à la fois à leurs caractéristiques structurales et fonctionnelles, mais également à la nature complexe de la biomasse lignocellulosique (riche en parois secondaires lignifiées). Dans le but d’identifier les paramètres clés pour une conversion efficace des hémicelluloses, constituants majeurs des lignocelluloses, nous avons centré notre étude sur l’endoxylanase (Tx-Xyl) de Thermobacillus xylanilyticus appartenant à la famille 11 des glycoside- hydrolases (GH11). Dans une approche biomimétique, nous avons étudié, l’action de la xylanase (Tx-Xyl) sur des substrats différents et de complexité croissante (hétéroxylanes isolés, assemblages de copolymères reconstitués in vitro. . . ). L’emploi de nano-composites hétéroxylanes extraits - lignines de synthèse (DHPs) nous a permis de souligner l’impact de l’agencement tridimensionnel des complexes covalents (LCC) sur la limitation de l’accessibilité des hétéroxylanes à l’enzyme. Une corrélation directe a pu, également, être établie entre l’augmentation du contenu en lignines des nano-composites et la baisse de l’activité de l’enzyme, suggérant des interactions non spécifiques directes enzyme-lignines. Par ailleurs, l’étude des interactions de Tx-Xyl avec divers acides hydroxycinamiques (p-coumarique, férulique, cafféique…) a permis de mettre en évidence un phénomène d’inhibition non compétitif de l’enzyme par ces composés phénoliques. Moyennant des outils de biologie moléculaire, nous avons développé une stratégie qui vise à modifier l’architecture protéique et/ou la spécificité de fixation de Tx-Xyl en la fusionnant via des séquences "linker" à des modules protéiques différents: le CBM1 de la cellulase Cel7A de Trichoderma reesei fixant spécifiquement la cellulose cristalline et la GFP (Green Fluoerescent Protein). Les protéines chimériques Tx-Xyl-CBM1 et Tx-Xyl-GFP obtenues sont moins efficaces sur les xylanes solubles (faible kcat) comparées à Tx-Xyl. Cependant, leurs modes d’action sur des substrats lignocellulosiques (tels que les coproduits du blé : paille et son de blé) semblent différents. En effet, des rendements d’hydrolyse légèrement augmentés sont obtenus dans le cas de Tx-Xyl-CBM1, suggérant un impact positif du CBM1 sur l’action de l’enzyme in situ, contrairement à Tx-Xyl-GFP dont la taille serait un facteur limitant sa diffusion/pénétration au sein des parois végétales