Etude et comparaison de la glycosylation de protéines natives et hétérologues : relations structure des oligosaccharides/propriétés enzymatiques
Institution:
Montpellier 2Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
More than half of eucaryotic proteins are glycoproteins. Oligosaccharides are N- or O-linked, their structure and composition differ and represent 1 to 80% of the total glycoprotein weight. Oligosaccharides functions are diverse: adjustement of protein physico-chemical properties, influence on its stability, protein-cell or cell-cell recognition…. They are implicated into many cellular functions and some of their structures are immunogenic. Glycosylation type depends on host protein producer and can be a limitating factor for the development of heterologous expression systems, especially for therapeutic protein production. We have chosen 2 model glycoproteins: the phytase of D. Castellii CBS 2923 and the b-glucosidase of C. Molischiana 35M5N. These 2 enzymes have been expressed into 2 heterologous yeasts, P. Pastoris and S. Pombe, in order to determine which part of glycosylation observed can be attributed to host’s nature and which to the protein itself. Genes cloning, wild-type and recombinant enzymes production and purification have been performed. Glycosylation (percentage, composition, structure, N-glycosylation sites occupancy) of each glycoprotein and each host has been studied by capillary electrophoresis and mass spectrometry. Otherwise, biochemical and catalytic properties of enzymes have been determined and linked to the observed glycosylation differences. Thermostability is the most modified property beetween enzymes. Enzymes produced by S. Pombe are more thermostable and glycosylated forms are more thermostable than the deglycosylated counterpart. D. Castellii et C. Molischiana exhibit a glycosylation close to the one realised by P. Pastoris. Their N-oligosaccharides are of inner core type and elongation is due to a-1,2 linked mannoses. Glycosylation of S. Pombe is atypical since it produces galactomannans longer than the oligomannosides observed in others cases. Oligosaccharides elongation is mainly carried out by galactose addition with various linkages (a-1,2 ; a-1,3 et b-1,3). Galactose and/or pyruvic acid explain the greater thermostability of glycoprotein produced by S. Pombe. The b-glucosidase of C. Molischiana is probably hyperglycosylated and possesses many non-covalently linked sugars (glucose in particular). O-glycosylation is presumably present in each protein and O-oligomannosides have been identified using mass spectrometry for the phytases produced by D. Castellii and P. Pastoris
Abstract FR:
Les glycoprotéines représentent la moitié des protéines eucaryotes. Elles possèdent des oligosaccharides N- et/ou O-liés, très hétérogènes en terme de structure et de composition et représentant de 1 à 80% de la masse de la glycoprotéine. Les rôles des oligosaccharides sont multiples : modulation des propriétés physico-chimiques de la protéine, influence sur sa stabilité, phénomène de reconnaissance… Ils sont impliqués dans diverses fonctions cellulaires et certaines structures sont immunogènes. Le type de glycosylation est fonction de l’hôte producteur peut être un facteur limitant au développement de certains systèmes d’expression hétérologues, notamment pour la production des protéines thérapeutiques. Notre système d’étude est basé sur 2 glycoprotéines modèles: la phytase de D. Castellii CBS 2923 et la b-glucosidase de C. Molischiana 35M5N. Afin d’évaluer l’importance de la nature de l’hôte et de celle de la protéine sur la glycosylation observée, ces 2 protéines ont été exprimées dans 2 hôtes hétérologues : P. Pastoris et S. Pombe. Le clonage des gènes, la production et la purification des enzymes natives et recombinantes ont été réalisés. La glycosylation (pourcentage, composition, structure, occupation des sites potentiels de N-glycosylation) a ensuite été étudiée pour chacune des glycoprotéines et dans chacun des hôtes par électrophorèse capillaire et spectrométrie de masse. Par ailleurs les propriétés biochimiques et catalytiques des enzymes natives et recombinantes ont été mises en relation avec les différences de glycosylation observées. La thermostabilité est la propriété la plus visiblement modifiée entre les enzymes. Les enzymes produites par S. Pombe sont en général plus thermostables et les enzymes glycosylées sont plus thermostables que leur contrepartie déglycosylée. La glycosylation réalisées par les 2 souches de levures non encore étudiées à ce jour, D. Castellii et C. Molischiana, est proche de celle réalisée par P. Pastoris. Les N-oligosaccharides sont de type interne et principalement maturés par l’ajout de mannoses liés en a-1,2. La glycosylation réalisée par S. Pombe est singulière puisqu’elle produit des galactomannanes plus longs que les oligomannoses observés dans les autres cas. La maturation des oligosaccharides est réalisée principalement par l’ajout de galactose avec des liaisons variées (a-1,2 ; a-1,3 et b-1,3). La présence de galactose et/ou celle d’acide pyruvique explique la plus grande thermostabilité observée pour les protéines produites par cet hôte. La b-glucosidase produite par C. Molischiana est sans doute hyperglycosylée et possède beaucoup de sucres liés de façon non covalente (glucose en particulier). La O-glycosylation est envisageable dans tous les cas et la présence d’O-oligomannosides a été mise en évidence par spectrométrie de masse pour les phytases produites par D. Castellii et P. Pastoris