Study of pontin and reptin in vitro activities
Institution:
Toulouse 3Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Pontin and reptin are essential proteins in yeast and embryonic-lethal in higher eukaryotes (Qiu X. B. Et al. , 1998; Wood M. A. Et al. , 2000) that share a high degree of similarity and have been highly conserved from yeast to human. They are implicated in a variety of cellular processes, such as chromatin remodeling during double-strand break (DSB) repair, transcriptional regulation and maintenance of genome stability (Gallant, 2007; Jha S. And Dutta A. , 2008). Pontin and reptin are found in several molecular complexes such as Ino80, TIP60 and Swr1 (Jha S. And Dutta A. , 2008). Pontin and reptin regulate many cancer-related pathways. Indeed, they are essential mediators of oncogenic transformation induced by c-Myc (Wood M. A. Et al. , 2000; Dugan K. A. Et al. , 2002) and beta-catenin (Feng Y. Et al. , 2003). In spite of high interest in their cellular function(s), their mechanisms of action remain unknown and its elucidation constitutes and important step toward understanding the numerous biological processes they are implicated in. Pontin and reptin contain conserved ATP-binding and hydrolysis motifs, such as Walker A and B motifs that are known to bind ATP and Mg2+ ions. Point mutations in the pontin or reptin Walker B box (DEVH -> NEVH) are non viable and show a dominant lethal growth phenotype in the yeast S. Cerevisiae (King T. H. Et al. , 2001). The same mutation in rat cell lines results in enhanced c-Myc activity (Dugan K. A. Et al. , 2002) and inhibition of beta-catenin-mediated neoplastic transformation (Feng Y. Et al. , 2003). However, these mutants have never been studied in vitro. Some evidence has indicated that pontin and reptin possess ATPase and helicase activity on ssDNA substrates (Kanemaki M. Et al, 1997; Makino Y. Et al. , 1999). However, further attempts to detect any activity failed (Ikura T. Et al. , 2000, Puri T. Et al. , 2007). Pontin and reptin were reported to form hexamers and heterododecamers, but whether monomeric or oligomeric forms constitute the biologically active of pontin and reptin has remained controversial (Puri T. Et al. , 2007; Gribun A. Et al, 2008; Torreira E. Et al, 2009). In order to define the biochemical properties of these proteins, we purified recombinant human pontin and reptin in both monomeric and hexameric forms and studied some of their basic properties. We initially demonstrated cooperative binding of pontin and reptin monomers to single-stranded and double-stranded DNA, leading to more detailed studies, showing that binding activates weak ATP hydrolysis and induces slow DNA unwinding. We have studied the incidence of different parameters on these activities, such as the length of single and double-stranded regions in DNA substrates, uncovering fundamental differences in the behavior of pontin and reptin. Unexpectedly, we discovered a striking new property of pontin and to a lesser extent reptin hexamers, which display a single strand-specific endonuclease activity. We have analyzed substrate preference and the cofactor requirement for this novel nuclease activity. We introduced point DEVH -> NEVH mutations into the pontin and reptin Walker B box. Taking into account the phenotype of these mutants in vivo or in cellulo, we endeavored to compare their in vitro properties to those of the wild-type proteins. Importantly, in the course of protein purification, the equilibrium between monomeric and hexameric fractions is shifted towards the hexameric form for both DEVH -> NEVH. We also introduced a single residue mutation into the Sensor II motif of pontin that was found mostly as monomers and height molecular weight aggregates with almost no hexamers after purification. We observed that a DEVH -> NEVH mutant that showed facilitated hexamer formation had higher ATPase and helicase activities, while the Sensor II mutant, that failed to form hexamers, exhibited weaker ATPase and helicase activities. Moreover, although nuclease activity of hexamers was ATP-independent, we could observe the induction of nuclease activity in a monomeric form of a wild type pontin and of a DEVH -> NEVH mutant in the presence of ADP cofactor. We suggest that induction of nuclease activity corresponds to hexamer formation. Our results suggest that the transition from monomer to hexamer is highly important for the regulation of the activity of these proteins. Oligomerization of pontin and reptin appears to modulate the transition from helicase to nuclease activities. This would imply that hexamerization is a closely controlled process and that oligomerization might occur over the course of an ordered cycle of action, proceeding from initial DNA binding, ATP hydrolysis and DNA unwinding, leading to endonucleolytic cleavage.
Abstract FR:
Les protéines essentielles Tip49 (pontin et reptin) font partie de la famille AAA+ (" ATPases associated with diverse cellular activities ") qui est composée d'enzymes impliqués dans des processus cellulaires divers. La propriété commune de ces enzymes semble être la capacité d'effectuer un remodelage des protéines et/ou d'acides nucléiques en consommant de l'ATP. Dans ce but, les protéines AAA+ portent des domaines conservés de liaison et d'hydrolyse de l'ATP - Walker A et B et Sensor I et II. Les protéines TIP49 sont hautement conservées à travers l'évolution (70% d'identité entre les protéines humaines et celles de la levure) et très similaires entre elles (40% d'identité). Malgré leur forte homologie, chacune des deux protéines est essentielle chez les eucaryotes. Leurs partenaires protéiques suggèrent qu'elles soient requises dans de nombreux processus cellulaires générant de l'ADN simple brin (réparation, recombinaison, réplication, transcription, remodelage de la chromatine et biogenèse des snoARN). Les premiers travaux sur les protéines purifiées les ont décrites comme des hélicases possédant une activité ATPase induite par l'ADN simple-brin. Depuis, la capacité à hydrolyser l'ATP des protéines purifiées a été fortement débattue et la fonction exacte de ces protéines reste complètement inconnue. Le projet sur lequel j'ai travaillé sous la direction de Dr. M. Grigoriev était une caractérisation en détail in vitro des activités enzymatiques des protéines TIP49 afin de comprendre leur mode d'action dans ces nombreux processus. Résultats : Afin de déterminer leur propriétés biochimiques, nous avons purifié des fractions hexamèrique et monomérique des protéines pontin et reptin. Nous avons trouvé que les monomères étaient actifs en hydrolyse de l'ATP. Cette activité ATPase est dépendante de l'ADN simple (ss) ou double brin (ds). Nous n'avons pas observé une activité ATPase pour la forme hexamérique. L'interaction entre l'ADNss et les protéines, responsable de l'activation de l'ATPase, a été observée par des expériences du retard sur gel. Nous avons montré que la reptin et la pontin lient l'ADN simple brin (ADNss) et l'ADN double brin (ADNds) de façon hautement coopérative. Les complexes formés entre la protéine et l'ADN sont hautement stables. Cette structure nucléoprotéique peut avoir un rôle biologique déterminé par sa stabilité. L'hexamère de reptin lie l'ADNss, mais les complexes hexamère-ADNss ne migrent pas de même façon qu'un complexe monomère-ADNss. En plus, la liaison était beaucoup moins efficace. Ces complexes hautement stables monomère reptin- ADNss peuvent être déstabilisés en présence de cofacteurs nucléotidiques - ADP ou ATP. Cette déstabilisation est accompagnée par l'apparition de bande sur le gel retard correspondant à celle d'hexamère. En présence de l'ATP un complexe met plus longtemps pour se déstabiliser - délai qui peut correspondre au temps nécessaire pour hydrolyser de l'ATP en ADP. Nous avons démontré la capacité de séparer deux brins dans le substrat contenant la partie simple et double brin en présence de l'ATP. Nous avons étudié cette activité hélicase dans les détails. Cette activité est spécifique de substrats 3'-5'. Nous avons démontré que la protéine reptin avait besoin de queues d'ADNss de 30 nucléotides minimum pour se charger sur le substrat et pour l'initiation de la réaction, tandis que la protéine pontin, à son tour, avait besoin l'ADNds assez long pour que la réaction soit efficace. De façon inattendue, nous avons mis en évidence aussi une activité endonucléase spécifique de l'ADNss dans la fraction hexamérique de la protéine. Comme nous avons dit, l'ADP est apparemment nécessaire pour la structuration de la forme hexamèrique. En accord avec ces résultats, nous avons pu voir l'induction de l'activité nucléase dans la fraction monomérique en présence d'ATP ou d'ADP. Pour mieux comprendre la relation entre les activités ATPase, hélicase et nucléase, nous avons nous avons obtenu les mutants ponctuels DEVH -> NEVH de reptin et pontin dans les régions Walker B - domaines qui participent à l'hydrolyse de l'ATP ainsi que un mutant ponctuel de pontin dans une région Sensor II. Nous avons montré que ces mutations déstabilisent l'équilibre entre l'état hexamérique et monomérique. De plus, les activités hélicase, ATPase et nucléase sont modifiées. Pris dans leur ensemble, ces résultats des travaux nous permettent de suggérer que l'oligomérisation des protéines pontin et reptin est hautement importante dans la contrôle de transition d'activité hélicase vers l'activité nucléase. Ces résultats servent à mieux comprendre leurs fonctions exactes dans les diverses voies métaboliques de l'ADN dans lesquelles elles sont impliquées.