Etude de la variabilité moléculaire de Pneumocystis jirovecii : du génotype à la variabilité antigénique
Institution:
Université de Paris (2019-....)Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Pneumocystis jirovecii is an atypical opportunistic pathogen of the fungal world. This cosmopolitan fungus, whose studies agree on a very probable airborne transmission between individuals, is encountered very early in life. P. jirovecii can be detected in the airways of all types of individuals, with or without symptoms, after exposure. Severe pneumonia secondary to the infection, called pneumocystosis (PCP), is observed only in immunocompromised patients. All infected individuals, both symptomatic (PCP) and asymptomatic carriers (PCC) would participate in the maintenance of the chain of transmission between individuals, and many outbreaks are described within health care wards. The number of pneumocystosis cases is estimated at 500,000/year worldwide, with mortality up to 40%. Historically diagnosed in HIV-infected patients not receiving HAART, pneumocystosis is now common in non-HIV immunocompromised patients. For these non-HIV immunocompromised patients the disease presents a more acute evolution and a higher mortality. The pathophysiology of this pneumonia is still poorly understood. Indeed, studies on this pathogen are limited by the lack of a culture system. Consequently, only molecular techniques applied directly to samples from infected patients are currently available to study transmission, genetic diversity and evaluate the performance of diagnostic approaches. In order to study transmission, the first theme of this work will focus on the development and validation of a genotyping method based on the analysis of genomic microsatellite markers (MLP). A monocentric study and a larger collaborative multi-center study, allowed the observation of a wide variety of genotypes and a high frequency (2/3) of genotype mixing in patients' samples. These two studies also allowed the identification of specific genotypes, found preferentially in kidney transplant subjects. Then, the comparison of the MLP method with the MLST genotyping technique allowed us to confirm performance. The development of this genotyping method, which has been shown to be effective for the detection of mixed genotypes, is therefore an appropriate tool for the selection of samples hosting a single genomic genotype, in order to subsequently search for a possible link between genotype and MSG surface antigens.Considering diagnosis approaches, qPCR is considered as the most sensitive method for the detection of the fungus. However, due to its high sensitivity, this approach also allows the detection of the fungus in samples from asymptomatic patients, then defined as asymptomatic carriers (PCC). Previous work carried out in our laboratory has allowed us to observe a better sensitivity of the mitochondrial mtSSU target compared to the mtLSU target, classically used in many laboratories. The second theme of this work was therefore, to study the impact of targets and material, amplified in qPCR, for the detection of P. jirovecii in respiratory samples.Then, a first European collaborative study determined that total nucleic acids (WNA=DNA +RNA) detection is earlier than DNA detection alone, and that the mtSSU target provided the earliest Cycles of Quantification (Cq). Finally, a prospective study, carried out on 120 patients samples, consisted in evaluating the performance of the two mitochondrial targets mtSSU and mtLSU, with DNA and WNA amplification for the detection of the fungus. The detection of the mtSSU WNA was confirmed as the earliest. In parallel with the performance evaluation, an evaluation of the benefit of the 2 mitochondrial genes expression ratio for PCP diagnosis strategy was performed. A ratio >5 presented a Negative Predictive Value of 100% for BAL and 87.5% for induced sputum specimens, to exclude PCP. This new, simple tool, based on the double detection of WNA from mtSSU and mtLSU, could be useful for patient management.
Abstract FR:
Pneumocystis jirovecii est un pathogène opportuniste atypique du monde fongique. Ce champignon cosmopolite, et transmissible, est rencontré très tôt au cours de la vie. P. jirovecii peut être détecté dans les voies respiratoires de tous types d’individus, avec ou sans symptômes, si ces derniers y ont été exposés. La pneumonie sévère secondaire à l’infection, nommée pneumocystose (PCP), n’est observée que chez les patients immunodéprimés. De nombreuses épidémies sont décrites au sein des services de soins. Le nombre de cas de pneumocytoses est évalué à 500 000/an dans le monde, avec une mortalité jusqu’à 40%. Historiquement diagnostiquée chez les patients infectés par le VIH, la pneumocystose est maintenant fréquente chez les patients immunodéprimés non-VIH. La physiopathologie de cette pneumonie est encore mal comprise. En effet, les études sur ce pathogène sont limitées par l'absence de système de culture. En conséquence, seules des techniques moléculaires sont applicables sur les prélèvements de pour étudier la transmission, la diversité génétique, et évaluer la performance des approches diagnostiques. Afin d’étudier la transmission, le premier thème de ce travail a porté sur le développement et la validation d’une technique de génotypage basée sur l’analyse de marqueurs microsatellites génomiques (MLP). Une étude monocentrique et une étude multi-centrique collaborative à plus large échelle, ont permis d’observer une grande variété de génotypes et une grande fréquence (2/3) des mélanges de génotypes dans les prélèvements respiratoires des patients. Ces deux études ont permis d’identifier des génotypes spécifiques, retrouvés préférentiellement chez des sujets transplantés rénaux. Par la suite, la comparaison de la méthode MLP à la technique de génotypage MLST a permis de confirmer sa performance. Le développement de cette méthode de génotypage, apparue comme performante pour la détection des mélanges de génotypes est donc un outil adapté pour la sélection d’échantillons hébergeant un génotype génomique unique, afin de rechercher ultérieurement un éventuel lien entre génotype et antigènes de surface. Concernant les méthodes diagnostiques, la qPCR est considérée comme la méthode la plus sensible pour la détection du champignon. Cependant, du fait de sa grande sensibilité, cette approche permet également de détecter le champignon dans les prélèvements de patients porteurs asymptomatiques (PCC). Des travaux antérieurs réalisés au sein de notre laboratoire nous ont permis d’observer une meilleure sensibilité de la cible mitochondriale mtSSU par rapport à mtLSU. Le second thème de ce travail a donc consisté à étudier l’impact des cibles et du matériel, amplifiés en qPCR, pour la détection de P. jirovecii. Pour cela, une première étude collaborative européenne, a permis de déterminer que la détection des acides nucléiques totaux (WNA=ADN +ARN) est plus précoce que la détection de l’ADN, et que la cible mtSSU permettait d’obtenir les Cycles de quantification (Cq) les plus précoces. Une étude prospective, réalisée sur 120 prélèvements de patients, a consisté à évaluer la performance des deux cibles mitochondriales mtSSU et mtLSU, avec amplification en ADN et en WNA. La détection des WNA mtSSU a été confirmée comme la plus précoce. Parallèlement à l’évaluation de la performance, une évaluation de l’intérêt du ratio d’expression des 2 gènes mitochondriaux dans la stratégie diagnostic de la pneumocystose a été réalisée. Un ratio >5 présentait une Valeur prédictive négative de 100% pour les LBA et 87.5% pour les expectorations induites, pour exclure la PCP. Ce nouvel outil, simple, basé sur la double détection des WNA de mtSSU et mtLSU, pourrait s’avérer utile pour la prise en charge des patients.