Fonctionnalisation d’une matrice végétale à base de pois protéagineux (Pisum sativum) par voie microbienne.
Institution:
université Paris-SaclayDisciplines:
Directors:
Abstract EN:
ROQUETTE transforms and valorizes peas (Pisum sativum) to produce proteins, fibers and starches. During this process, various secondary fractions are generated, including the pea soluble, designated LAB 4960 after atomization. This fiber-rich co-product is unfit for human consumption in its current form as it can cause digestive disorders, caused by the high content of α-GOS, α-galactooligosaccharides formed from 1 to 3 galactose units linked by α-(1-6) bonds. Among the α-GOS are raffinose, stachyose and verbascose which are not digested by humans, but fermented by the intestinal microbiota. The aim of this thesis project is therefore to reduce the α-GOS content of LAB 4960 by microbial fermentation in order to improve its digestibility. To achieve this objective, a twofold strategy has been implemented. In a first part, a microbial collection that is very diverse in terms of species and ori-gins (plant vs. animal) was built up from pea seeds with the characteri-zation of the microbial diversity of peas from different terroirs and from the private collections of the INRAE Laboratory and the ROQUETTE Company. In a second part, the constituted collection was tested for its ability to hydrolyze the α-GOS from LAB 4960. The screening of the strains was split into three steps, involving different selection criteria. Step 1 allowed the selection of strains capable of growing on LAB 4960 agar under two conditions of oxygenation (aerobic and anaerobic) and pH (acidic and neutral). Step 2 allowed the identification of sugars by Thin-layer chromatography after 72 hours of culture on the liquid LAB 4960. The strains that reduced the α-GOS were selected in step 3 for the quantification of sugars by High performance liquid chromatog-raphy coupled to mass spectrometry. In the first part, the metagenetic study of pea surface diversity according to different terroirs after soak-ing, showed a strong dominance of bacterial species belonging to Proteobacteria (57%) and Firmicutes (28%) and fungal species be-longing to Ascomycota (89%) and Basidiomycota (11%). The structure of the epiphytic community associated with the pea seed was strong-ly influenced by its origin (storage cooperatives and countries). From the pea seed soaking juice, 102 strains were isolated and assigned to 52 species. The 52 pea strains representative of each identified spe-cies were added to the 157 strains representative of 82 microbial species in the internal collections. Screening of the collection showed that 89% of the strains tested were capable of growing on LAB 4960 agar. About 20% of the strains degraded only sucrose. The occurrence of sugars as melibiose, manninotriose and manninotetraose, known to be the product of defructosylation, suggested that 19% of the strains hydrolyzed α-GOS by a β-fructosyltransferase of which 4% came from peas. Finally, 4% of the strains hydrolyzed α-GOS by an α-galactosidase, of which 1% came from peas. Among the 23% strains hydrolyzing α-GOS, two strains stood out for their strong hydrolytic activity: Candida pseudoglaebosa CBS 6715T and Serratia liquefa-ciens GBM09. A study on minimum medium, LAB 4960 medium and in a bioreactor on LAB 4960 of different concentrations showed that, under optimal growth conditions, the GBM09 bacterium is capable of hydrolyzing the α-GOS in increasing order of degree of polymeriza-tion at neutral pH and at 20°C whereas the yeast CBS 6715T hydro-lyzes all the α-GOS simultaneously at acid pH and at 28°C.These preliminary trials have made it possible to validate a proof of con-cept for a fermented functional food and hold out promise of their development on an industrial scale, paving the way for many innova-tions.
Abstract FR:
ROQUETTE transforme et valorise le pois (Pisum sativum) pour produire des protéines, des fibres et des amidons. Au cours du procédé, diffé-rentes fractions secondaires sont générées dont le soluble de pois, désigné LAB 4960 après atomisation. Ce coproduit riche en fibres est inapte pour la nutrition humaine car il peut causer des désordres diges-tifs, engendrés par la forte teneur en α-GOS, des α-galacto-oligosaccharides formés de 1 à 3 unités de galactose liées par des liaisons α-(1-6). Parmi les α-GOS, on retrouve le raffinose, le stachyose et le verbascose qui sont non digérés par l’homme mais fermentés par le microbiote intestinal. L’objectif de ce projet de thèse est donc de ré-duire la teneur en α-GOS du LAB 4960 par voie microbienne afin d’en améliorer sa digestibilité. Pour atteindre cet objectif, une stratégie a été mise en place en deux temps. Dans une première partie, une collec-tion microbienne très diverse en termes d’espèce et d’origine (végétale vs animale) a été constituée à partir de graines de pois avec la caracté-risation de la diversité microbienne du pois de différents terroirs et à partir des collections internes de l’INRAE et de la société ROQUETTE. Dans une deuxième partie, la collection a été testée pour son aptitude à hydrolyser les α-GOS du LAB 4960. Le criblage de souches a été réparti sur trois phases, impliquant différents critères de sélection. La phase 1 a permis de sélectionner les souches capables de croître sur le LAB 4960 gélosé dans deux conditions d’oxygénation (aérobie et anaérobie) et de pH (acide et neutre). La phase 2 a permis d’identifier les sucres par Chromatographie sur Couche Mince après 72 h de culture sur le LAB 4960 liquide. Les souches ayant réduit les α-GOS ont été retenues en phase 3 pour le dosage des sucres par Chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse. Dans la première partie, l’étude par métagénétique de la diversité de la surface de pois de différents terroirs après trempage, a montré une forte dominance d’espèces bactériennes appartenant aux Proteobacteria (57%) et Firmicutes (28%) et d’espèces fongiques appartenant aux Ascomyco-ta (89%) et Basidiomycota (11%). La structure de la communauté épiphyte associée à la graine de pois a été fortement impactée par son origine (coopératives et pays). A partir du jus de trempage des graines de pois, 102 souches ont été isolées et assignées à 52 es-pèces. Les 52 souches du pois représentatives de chaque espèce identifiée ont été ajoutées aux 157 souches représentatives de 82 espèces microbiennes des collections internes. Dans la seconde partie, le criblage de la collection a montré que 89% des souches testées ont pu croître sur le LAB 4960 gélosé. A peu près 20% des souches ont dégradé uniquement le saccharose. L’apparition des sucres mélibiose, manninotriose et manninotétraose traduisant une défructosylation a suggéré que 19% de souches ont hydrolysé les α-GOS via une β-fructosyltransférase dont 4% provenaient du pois. Enfin, 4% des souches ont hydrolysé les α-GOS via une α-galactosidase dont 1% provenait de pois. Sur les 49 (23%) souches hydrolysant les α-GOS, deux souches se sont démarquées par leur forte activité hydrolytique : Candida pseudoglaebosa CBS 6715T et Serratia liquefaciens GBM09. Une étude sur milieu minimum, milieu LAB 4960 et en bioréacteur sur LAB 4960 de concentrations diffé-rentes a montré que, dans des conditions optimales de croissance, la bactérie GBM09 est capable d’hydrolyser les α-GOS par ordre de degré de polymérisation croissant à pH neutre et à 20°C alors que la levure CBS 6715T hydrolyse l’ensemble des α-GOS simultanément à pH acide et à 28°C. Ces essais préliminaires ont permis de valider une première preuve de concept d’un aliment fonctionnel fermenté et laissent espérer favorablement leur développement à l’échelle industrielle en ouvrant la voie à de nombreuses innovations