Etude de l'attachement et de l'entrée du virus LIoviu (LLOV) à la cellule hôte et exploration du virome de carnivores de la faune française
Institution:
Université de Paris (2019-....)Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
The Filoviridae family comprises three genera: Ebolavirus, Marburgvirus, and Cuevavirus. The pathogenicity of filoviruses in humans varies between different genera of filovirus, and between different species of the same genus. Thus, there is no data in favor of a pathogenicity of Ebola Reston in humans, or Cuevavirus (genus created in 2012 following the discovery of the Lloviu virus). We studied the entry of Lloviu virus into different target cells. Since there is no isolate of this virus, we used a system of filoviral pseudoparticles (VLP), developed by Thomas Hoenen and Heinz Feldmann (NIAID-NIH, USA), based on a tetracistronic minigenome, containing the genes GP, VP40 and VP24 of Ebolavirus Mayinga (variant of the 1976 epidemic), and the luciferase reporter gene, as well as expression vectors for VP30, VP35, NP and L proteins of Ebolavirus Mayinga. This system makes it possible to produce filoviral VLPs of bona fide morphology which have been described as up to 500 times more infectious ex vivo than VLPs produced by overexpression of VP40 and GP. It makes it possible to study the entire viral cycle and to generate other VLPs at each passage.The production of filoviral VLPs carrying the GP of Ebolavirus Mayinga gives infectious VLP production levels in HEK 293T cells (quantification of luciferase activity in P1 to P3 target cells) comparable to those obtained by the authors (Watt et al. 2014).By replacing the GP of the Mayinga Ebola virus with the GP of Lloviu virus prototype Cuevavirus (filovirus found in Schreibers' bat; his GP has 34% amino acid homology with the GP of the Ebola Mayinga virus), we develop a heterologous system yielding infectious VLP production levels in HEK 293T cells comparable to the original system. This system uses the TIM-I receptor (T cell immunoglobulin mucin I), known to promote the entry of Ebola virus into these target cells. We have tried to test the role of this receptor for the entry of filoviral pseudoparticles carrying the GP of the Lloviu virus into HEK 293T and VERO E6 target cells. The results suggest that TIM-I expression in the HEK 293T target cells improved the entry of the filoviral VLPs carrying the GP of Lloviu virus, in contrast to the VERO E6 target cells.We then sought, by homology of sequences with mutations known to have a deleterious effect on the entry of the Ebola virus, to identify the important residues on the GP of Lloviu virus for the interaction with the TIM-I receptor. The results show that some of these mutations would also have a deleterious effect on the entry of the filoviral pseudo-particles carrying the GP of Lloviu virus. The Lloviu virus is the first filovirus found in Europe, and this only in Schreibers' bat. We have sought, by specific methods of molecular biology, the presence of filovirus in different samples of small carnivores of the wild fauna of the south-west of France, notably polecats, the wild form of the ferrets, themselves used as models animals for the in vivo study of filovirus infection. We did not detect a filovirus genome. We explored by next-generation sequencing (NGS) the virome of these polecats. We confirmed the absence of filovirus genome in these polecat samples, but we detected the presence of kobuvirus genome. In order to obtain the entire genome of this virus, sequencing by the SANGER method, and by MinION technology were undertaken. We were able to sequence approximately 80% of the kobuvirus genome. Kobuvirus is a picornavirus, a small, highly variable RNA virus. However, phylogenetic analyzes showed a great similarity with the kobuvirus sequences detected in the ferret.
Abstract FR:
La famille des Filoviridae comprend trois genres : Ebolavirus, Marburgvirus, et Cuevavirus. Le pouvoir pathogène des filovirus chez l’homme varie entre les différents genres de filovirus, et entre différentes espèces d’un même genre. Ainsi, il n’y a pas de données en faveur d’un pouvoir pathogène d’Ebola Reston chez l’homme, ni des Cuevavirus (genre récemment créé en 2012 suite à la découverte du virus Lloviu). Nous avons étudié l’entrée du virus Lloviu dans différentes cellules cibles. Dans la mesure où il n’y a aucun isolat de ce virus, nous avons utilisé un système de pseudo-particules filovirales, développé par Thomas Hoenen et Heinz Feldmann (NIAID-NIH, USA), basé sur un minigenome tétracistronique, contenant les gènes GP, VP40 et VP24 d’Ebolavirus Mayinga (variant de l’épidémie de 1976), et le gène rapporteur luciférase, ainsi que des vecteurs d’expression pour les protéines VP30, VP35, NP et L d’Ebolavirus Mayinga. Ce système permet de produire des VLP filovirales de morphologie bona fide qui ont été décrites comme étant jusqu’à 500 fois plus infectieuses ex vivo que des VLPs produites par surexpression de VP40 et GP. Il permet d’étudier l’ensemble du cycle viral et de générer d’autres VLP à chaque passage. La production de VLP filovirales portant la GP d’Ebolavirus Mayinga donne des niveaux de production de VLP infectieuses dans les cellules HEK 293T (quantification de l’activité luciférase dans les cellules cibles P1 jusqu’à P3) comparables à ceux obtenus par les auteurs décrivant ce système (Watt et al. 2014). En remplaçant la GP du virus Ebola Mayinga par la GP du Cuevavirus prototype Lloviu virus (filovirus retrouvé uniquement chez la chauve-souris Miniopterus schreibersii dont la GP présente 34% d’homologie en acides aminés avec la GP du virus Ebola Mayinga), nous avons mis en place un système hétérologue donnant des niveaux de production de VLP infectieuses dans les cellules HEK 293T comparable au système initial. Ce système utilise le récepteur TIM-1 (T cell immunoglobulin mucin I), connu pour favoriser l’entrée du virus Ebola dans ces cellules cibles. Nous avons cherché à tester le rôle de ce récepteur pour l’entrée des pseudo-particules filovirales porteuses de la GP du virus Lloviu, dans des cellules cibles HEK 293T et VERO E6. Les résultats suggèrent que l’expression de TIM-1 dans les cellules cibles HEK 293T améliore l’entrée des pseudo-particules filovirales porteuses de la GP du virus Lloviu, contrairement aux cellules cibles VERO E6. Nous avons alors cherché, par homologie de séquences avec des mutations connues pour avoir un effet délétère sur l’entrée du virus Ebola, à identifier les résidus importants sur la GP du virus Lloviu pour son interaction avec le récepteur TIM-1. Les résultats montrent que certaines de ces mutations auraient aussi un effet délétère sur l’entrée des pseudo-particules filovirales porteuses de la GP du virus Lloviu. Le virus Lloviu est le premier filovirus découvert en Europe, et ce uniquement chez les chauves-souris Miniopterus schreibersii. Nous avons cherché, par des méthodes spécifiques de biologie moléculaire, la présence de filovirus dans différents échantillons de petits carnivores de la faune sauvage du Sud-Ouest de la France, notamment des putois, la forme sauvage des furets, eux-mêmes utilisés comme modèles animaux pour l’étude in vivo d’infection aux filovirus. Nous n’avons pas détecté de génome de filovirus. Nous avons exploré par séquençage haut débit (NGS) le virome de ces putois. Nous avons confirmé l’absence de génome de filovirus dans ces échantillons provenant de putois, mais nous avons détecté la présence de génome de kobuvirus. Afin d’obtenir la totalité du génome de ce virus, un séquençage par la méthode SANGER, et par la technologie MinION a été entrepris. Nous avons pu ainsi séquencer environ 80% du génome du kobuvirus.