La ségrégation du plasmide F d'Escherichia coli : étude des spécificités d'interaction du centromère avec la protéine SopB et organisation du complexe de partition étendu
Institution:
Toulouse 3Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Segregation of genetic material over generations is an essential process ensuring that every daughter cell receives a copy of each DNA molecule. Similarly to Eukaryotes, Prokaryotes possess cytoskeletal machineries, named Par, responsible for DNA segregation. Bacterial Par systems, found on chromosomes as well as on various low copy number plasmids, are composed of three elements: a ParA protein, a ParB protein and a centromere site, parS. ParA ATPase is able to position plasmids in the cytoplasm during the cell cycle. Its dynamic pattern make it the motor of the partition. The centromere binding protein (CBP) ParB, binds the centromere to form a nucleoprotein assembly called the "partition complex". Using different mode of DNA binding and multiple protein-protein interactions, ParB is also capable of organizing into higher order complexes called the "extended" partition complex. This complex is the substrate for the partitioning process. Formation of the extended partition represents the first step in partition and is essential to segregation. The architecture of this complex is not known for any partition system parABS. Here, we focus on the assembly of the F partition complex. During my PhD, I initiated several projects in parallel to characterize the different interactions involved in the organization of the partition complex and the extended partition complex of this plasmid with in vivo and in vitro approaches. In collaboration with the laboratory of Dr. Veronique Le Berre in Toulouse (LISBP -INSA), we determined sopC basis involved in specific SopB-sopC interactions. Then, we identified a new ParB determinant, outside of the helix-turn-helix DNA binding motif, responsible for specific DNA binding to the centromere. These findings reveal that ParB have an extended DNA binding domain, composed of two separate DNA binding motifs. We extended our analysis to chromosomal ParB and show that this second centromere binding motif is highly conserved in a wide range of bacteria. Using in vivo and in vitro approaches, we show that the extended partition complex architecture requires both protein-protein and protein-DNA interactions. To investigate the overall organization of the SopB-sopC extended partition complex, we use chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled with high throughput sequencing. This technique allowed us to visualize that SopB is able to extend around sopC over ~20 Kb. Our results are thus inconsistent with previous models suggesting that SopB polymerize side by side in a proteo-nucleofilament emanating from the centromere. So, we propose a new model in which the extended partition complex of F plasmid assembles in a nucleoprotein complex from stochastic binding of SopB on neighboring sopC DNA.
Abstract FR:
La ségrégation du matériel génétique est une étape fondamentale du cycle cellulaire permettant la transmission du patrimoine génétique au cours des générations. Dans les cellules eucaryotes, la mitose est l'étape qui permet la répartition des chromosomes dupliqués dans chaque cellule fille. Des systèmes actifs, dédiés à la ségrégation de l'ADN sont retrouvés sur la majorité des plasmides et chromosomes bactériens. Ces systèmes ParABS, dits "de partition", sont constitués de deux protéines, ParA et ParB, et d'une séquence centromérique, parS. La protéine ParA est une ATPase capable de positionner les plasmides dans le cytoplasme tout au long du cycle cellulaire. Son comportement dynamique fait d'elle le moteur de la partition. La protéine ParB, l'autre acteur de la partition est une protéine adaptatrice entre la molécule d'ADN et la protéine motrice. ParB se fixe sur le centromère parS pour former une complexe nucléoprotéique appelée "complexe de partition". En utilisant différents modes de fixation à l'ADN et en établissant des interactions protéine-protéine multiples, ParB est aussi capable de s'organiser en complexe de partition dit "étendu" qui est le substrat de la réaction de ségrégation. La formation du complexe de partition "étendu" est la première étape du mécanisme de partition et est essentielle au processus de ségrégation. L'architecture de ce complexe n'est connue pour aucun des systèmes de partition parABS. L'un des systèmes modèles majeurs du mécanisme de ségrégation de l'ADN chez les bactéries est le système sopABC du plasmide F d'E. Coli. Ainsi, au cours de ma thèse, j'ai initié plusieurs projets en parallèle, visant à caractériser à la fois in vivo et in vitro, les différentes interactions impliquées dans l'organisation du complexe de partition et du complexe de partition "étendu" de ce plasmide. En collaboration avec l'équipe du Dr Véronique Le Berre au Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés (LISBP-INSA) de Toulouse, j'ai contribué à la validation des déterminants nucléiques impliqués dans l'interaction de notre séquence centromérique modèle, parS, avec le motif hélice-tour-hélice (HTH) de ParB. Ensuite, nous avons identifié un nouveau motif en dehors du motif HTH et montré qu'une arginine de ce motif est essentielle à l'interaction spécifique avec le centromère. Ces résultats ont révélé une caractéristique conservée dans le règne bactérien : les protéines ParB contiennent un domaine de liaison au centromère, composé de deux motifs séparés et essentiels. Le cœur de mes travaux de thèse a été de comprendre l'organisation du complexe de partition "étendu" et son rôle dans la partition. Par une combinaison d'approche moléculaire in vivo et in vitro, j'ai montré que l'architecture de ce complexe étendu en dehors des sites parS, nécessitait deux types d'interaction, des interactions protéine/protéine mais également ADN/protéine. Afin d'étudier le mode d'interaction de ParB avec des séquences nucléiques non spécifiques avoisinant le complexe de partition, j'ai mis en œuvre une technique d'immunoprécipitation de chromatine, couplée à des techniques de hautes détections (qPCR ou ChIPseq). Cette technique nous a permis de montrer que ParB est capable de s'étendre sur une distance d'environ vingt kilobases de part et d'autre du centromère. Nos résultats semblent incompatibles avec le précédent modèle dans lequel ParB serait capable de polymériser sur l'ADN, à la manière d'un protéo-nucléofilament qui s'initierait au niveau du centromère. Ainsi ces travaux, nous ont permis de proposer un nouveau modèle dans lequel le complexe de partition "étendu" serait une structure concentrée, dynamique et résultant d'interactions stochastiques entre ParB et l'ADN avoisinant ParS.