Analyse fonctionnelle de la phosphatidyglycérol : prolipoprotéine diacylglycéryl transférase (Lgt) chez Escherichia coli
Institution:
Paris 7Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Twenty to thirty per cent of the bacterial proteins are membrane proteins. Among them, lipoproteins are characterised by their acylated N-terminus. Lipoproteins are N-acylated in a three-step modification pathway involving three different enzymes: Lgt, Lsp and Lnt. Despite its essential role in lipoprotein modification, the reaction catalysed by phosphatidylglycérol"prolipoprotein diacylglycéryl transferase (Lgt) is still poorly understood. In this study, we demonstrated that Lgt is integrated into the inner membrane of Escherichia coll. Combining a bioinformatical analysis, beta-galactosidase and alkaline phosphatase fusion to Lgt, and the substituted cysteine accessibility method (SCAM), we demonstrated that Lgt crosses the inner membrane seven times. Construction of a conditional Igt null mutant showed that Igt is essential both in presence and in absence of the major lipoprotein, Lpp. In order to identify the catalytic site of the enzyme, highly conserved residues were substituted into alanine, and the ability of the constructed alanine mutants to complement the conditional Igt mutant was tested. Thus, substitution into alanine of Tyr26, Asn146 and Glyl54 residues inactivated Lgt. On the contrary, substitution of Asp129, Gly104 and Gly98 did not inactivate the enzyme. The alanine substitution of residues Arg143, Glu151, Arg239 and Glu243 were identified as affecting the enzyme activity without inactivating the enzyme.
Abstract FR:
II est estimé que 20 à 30% des protéines bactériennes sont des protéines membranaires. Parmi elles se trouve la classe des lipoprotéines caractérisées par Facylation de leur extrémité N-terminale. Le processus de N-acylation fait intervenir séquentiellement les enzymes Lgt, Lsp et Lnt. Malgré le rôle essentiel de la phosphatidylglycérol::prolipoprotéine diacylglycéryl transférase (Lgt), son mécanisme d'action reste encore mal connu. Au cours de ce travail nous avons montré que Lgt est une enzyme intégrée dans la membrane interne Escherichia coli. Par une approche combinant une analyse bioinformatique, la fusion de la beta-galactosidase et de la phosphatase alcaline à Lgt, et par une méthode d'accessibilité des cystéines à des agents alkylants (SCAM), nous avons mis en évidence que Lgt traverse la membrane interne à sept reprises. La construction d'un mutant Igt conditionnel a également permis de démontrer l'essentialité de Igt en présence comme en absence de la lipoprotéine majeure, Lpp. Afin d'identifier le site catalytique de Lgt, des résidus hautement conservés ont été substitués en alanine, et la capacité des mutants à complémenter le mutant Igt conditionnel a été testée. Ainsi, la substitution en alanine des résidus Tyr26, Asnl46 et Gly154 inactive Lgt. À l'inverse, la substitution de l'Asp129, de la Gly104 et de la Gly98 n'inactive pas l'enzyme. Les résidus Arg143, Glu151, Arg239 et Glu243 ont été identifiés comme n'inactivant pas Lgt, mais comme affectant son activité.