Caractérisation génétique, biochimique et structurale de l’ATP synthase des mycobactéries, la cible d’un nouvel antituberculeux de la famille des diarylquinolines
Institution:
Paris 6Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
TMC207 is a new antituberculous drug, which inhibits very efficiently the ATP synthase of mycobacteria such as M. Tuberculosis, one of the most important pathogens in the world. In order to map the amino acid residues involved in the binding of the drug, we have selected in vitro TMC207-resistant mutants from M. Tuberculosis and diverse atypical mycobacteria. Six distinct mutations, D28G, D28A, L59V, E61D, A63P and I66M, have been identified in the subunit c forming a c-ring in the ATP synthase. They were studied by evaluating the levels of resistance they confer in the selected clones and in M. Smegmatis by using an isogenic complementation system. The rates of increase of TMC207 MIC values were interpreted by constructing by homology modeling a structure of the c-ring which was used for docking simulations with TMC207. Our results suggest that the residues found to be mutated in the resistant clones, together with a tyrosine specifically conserved at position 64, define a cleft located between two adjacent c subunits in the c-ring. This cleft, which encompasses the proton binding site, is well fitted to bind TMC207 at the level of the bromo-quinoline moiety, the drug being anchored by several bonds. Finally, we have expressed and purified the mycobacterial ATP synthase in order to begin the structural study of this enzyme by electron microscopy and x-ray diffraction. Our results of electron microscopy allow obtaining the first images of the ATP synthase of M. Smegmatis
Abstract FR:
Le TMC207 est un nouvel antituberculeux appartenant à la famille des diarylquinolines qui inhibe très efficacement l’ATP synthase des mycobactéries. Dans le but de cartographier les interactions entre le TMC207 et sa cible et de comprendre le mécanisme d’action exact de cette nouvelle drogue, nous avons sélectionné in vitro des mutants résistants au TMC207 à partir de plusieurs espèces mycobactériennes. Six mutations distinctes ont été identifiées dans l’anneau c de l’ATP synthase: D28G, D28A, L59V, E61D, A63P et I66M. L’effet de ces mutations dans la résistance a été évalué en mesurant le niveau de résistance conféré dans les clones résistants, ainsi que dans un système de complémentation chez M. Smegmatis. Les résultats ont été interprétés grâce à la construction d’un modèle structural de l’anneau c, utilisé pour faire des expériences de docking avec le TMC207. Nos résultats montrent que les résidus substitués dans les clones résistants définissent une poche localisée entre deux sous-unités c adjacentes dans l’anneau, englobant le site de fixation du proton, qui permet la stabilisation du TMC207. La drogue bloque ainsi le transfert des protons et la synthèse d’ATP. Pour finir, nous avons mis au point l’expression et la purification de l’ATP synthase mycobactérienne afin d’initier l’étude structurale de ce macro-complexe en microscopie électronique et en cristallographie des protéines. Les résultats obtenus en microscopie électronique en coloration négative nous ont permis d’obtenir les premières images de l’ATP synthase de M. Smegmatis