Abstract FR:

L'extension de la chromatographie d'affinité dans les conditions de la HPLC ou à l'échelle préparative se limite à la difficulté d'obtention des phases stationnaires possédant à la fois des propriétés mécaniques suffisantes et une capacité de couplage des ligands actifs raisonnables. Dans cette étude, nous proposons de modifier la silice par enrobage avec un polysaccharide (dextrane ou agarose) substitué par une quantité calculée de fonctions diethylaminoethyl (DEAE) chargés positivement. Cette enrobage permet une neutralisation des fonctions silanoles présentes à la surface de la silice. L'étude des propriétés des supports en chromatographie d'exclusion stérique haute performance des protéines a permis de tester l'inactivation des phases minérales et de définir les conditions permettant une diminution des interactions non spécifiques du matériau mineral avec les protéines en solution. Ces supports qui conservent les propriétés mécaniques initiales de la silice peuvent aussi être facilement actives et couplés en utilisant les méthodes mises au point pour les supports de chromatographie d'affinité conventionnels. Nous avons pu ainsi coupler différents ligands naturels (proteine A, concanavaline A, heparine, fucane, dermatane sulfate) et synthétiques (CMDBS et phosphodextrane) en utilisant comme agent de couplage le 1,1'-carbonyl-diimidazole (CDI) ou le 1,4'-butanediol diglycidyl ether (EBDG). Ces supports d'affinité à base de silice enrobée ont été utilisés pour purifier differentes protéines plasmatiques. Ainsi les supports portant l'héparine ou le CMDBS permettent la séparation et la purification de l'antithrombine à partir d'une fraction plasmatique avec un rendement important conduisant à une protéine d'activation spécifique élevée (3, 4u mg). Ces supports ont permis ainsi la purification de la thrombine en une seule étape permettant d'obtenir à partir d'un échantillon commercial une thrombine d'activité élevée (2000-25000 unih/mg). Enfin, des essais préliminaires montrent que sur certains supports actifs il est ainsi possible de purifier le deuxième cofacteur de l'héparine à partir du plasma ou de séparer certains facteurs vitamine k dépendants de l'ensemble des facteurs actives.