Abstract FR:

Durant ce memoire, l'etude structurale de sites proteiques a ete abordee par deux approches basees sur l'utilisation de la microscopie electronique. La premiere de ces approches concerne la localisation d'epitopes du recepteur nicotinique de l'acetylcholine de part et d'autre de la membrane plasmique. Une methode combinant les dosages de type elisa et l'immunomicroscopie electronique a ete developpee a partir de fragments de membranes de torpedo marmorata. Nous avons montre que la liaison d'anticorps diriges contre un epitope extracellulaire s'effectue avec une stchiometrie proche de l'unite. La liaison de ces anticorps aux membranes est visualisable par microscopie electronique, dans les conditions de concentration definies par elisa. D'autre part, la liaison d'anticorps diriges contre un epitope intracellulaire a ete quantifiee et visualisee apres permeabilisation des vesicules en presence d'ions zinc et de sucrose. Le protocole ainsi developpe est generalisable a d'autres proteines membranaires, a condition que des anticorps sequentiels de forte affinite et de specificite connue soient disponibles. Dans une seconde partie, nous avons caracterise les differentes etapes menant a la localisation de sites proteiques au moyen d'une sonde de petite taille, dense aux electrons, constituee d'un ensemble de onze atomes d'or. La toxine du cholera a ete utilisee comme systeme modele en raison de la presence d'un seul pont disulfure au niveau duquel la sonde peut etre couplee, et de la possibilite d'obtention de cristaux bidimensionnels adaptes aux methodes d'analyse d'images. La position de la sonde au sein de la proteine a ete determinee par analyse d'images de specimens colores negativement. Une etude en cryomicroscopie electronique est en cours. L'objectif est d'utiliser cette sonde pour etudier la structure de sites pharmacologiques et immunologiques du recepteur de l'acetylcholine, en couplant la sonde a des marqueurs specifiques tels qu'une alpha-toxine ou des fragments fab