Abstract FR:

Au cours de l'etape d'elongation de la synthese proteique, le facteur d'elongation ef-2 joue un role primordial. Il catalyse, en presence de gtp, la translocation du peptidyl arnt du site a au site p du ribosome qui s'accompagne du mouvement du ribosome le long de l'arn messager. Actuellement, le mecanisme moleculaire de la translocation reste mal connu. Il implique des interactions specifiques entre trois composants : ef-2, le ribosome et le gtp. Au niveau du ribosome, trois proteines phosphorylees de la grande sous-unite p0, p1 et p2 sont necessaires a l'activite gtpase de ef-2 et semblent impliquees dans l'interaction avec le facteur au cours de la translocation. Les proteines acides p1 et p2 des ribosomes de foie de rat ont ete surproduites pour la premiere fois par biologie moleculaire dans divers systemes bacteriens d'expression (pgex-kt et pqe-30), afin d'etudier leurs interactions avec ef-2 et le role respectif de leur phosphorylation dans l'activite du facteur d'elongation. Les proteines recombinantes ainsi obtenues presentent les memes caracteristiques que les proteines natives : elles sont phosphorylables in vitro par la caseine kinase ii en presence de gtp ou d'atp et elles sont reconnues comme les proteines acides extraites des sous-unites 60s par un anticorps monoclonal dirige contre leur extremite c-terminale. Les sous-unites 60s ont ete traitees par l'anhydride de l'acide dimethylmaleique (dmma) afin d'obtenir des cores depourvus notamment des proteines acides p1 et p2. Des reconstitutions partielles des sous-unites 60s ont ensuite ete realisees en ajoutant au core dmma les proteines recombinantes phosphorylees ou non. L'activite des sous-unites 60s ainsi reconstituees a ete testee par mesure de la synthese de polyphenylalanine. Il apparait tout d'abord que les proteines non phosphorylees peuvent se reassocier aux ribosomes. La phosphorylation n'est donc pas le mecanisme par lequel la cellule regule l'attachement des proteines acides au ribosome. D'autre part, la presence des deux proteines ainsi que la phosphorylation de p2 est indispensable pour l'activite des sous-unites partiellement reconstituees car seule p2 phosphorylee en presence de p1 peut restaurer 63% de l'activite des sous-unites. La formation des complexes ternaires ef-2/sous-unites reconstituees/gtp ou gdp ainsi que l'activite gtpase des sous-unites necessitent egalement la phosphorylation de p2 ainsi que la presence de p1. Ces tests plus reduits impliquent uniquement ef-2 et mettent en evidence un role particulier de p1 et p2 dans la fixation du facteur d'elongation. Finalement, des etudes de spectrofluorescence montrent que p2 phosphorylee interagit avec ef-2.