Abstract FR:

Ce travail a consiste, dans un premier temps, a caracteriser au niveau moleculaire les genes codant pour l'activite chitine synthase, puis dans un deuxieme temps, a caracteriser au niveau biochimique ces enzymes de biosynthese de la chitine, et enfin a definir le role morphogenetique de cet enzyme. L'amplification par pcr de fragments d'adn, identifies aux genes de chitine synthase, chez trois oomycetes: saprolegnia monoica, phytophthora capsici et achlya ambisexualis nous a permis de montrer que la chitine avait finalement une distribution bien plus large, presente chez les pseudo- et les vrais- champignons. Le sequencage du produit pcr de s. Monoica a revele l'existence de deux genes chs. Leur localisation chromosomique a ete determinee par hybridation des chromosomes separes par electrophorese en champ pulse (chef). Un fragment pcr de s. Monoica a ete utilise comme sonde pour cribler la banque d'adn genomique. Le gene chs2 isole, code pour une proteine de 99 kda dont la structure secondaire predite est caracterisee par un grand domaine cytosolique et par une region transmembranaire c-terminale. L'analyse par rt-pcr a montre que les deux genes sont exprimes des les premieres minutes de regeneration des protoplastes et au cours de la croissance hyphale. La production de proteines recombinantes nous a permis d'obtenir des anticorps polyclonaux diriges contre les regions n-terminale et neutre de la proteine chs2. Les western-blots, realises avec les deux serums sur des fractions de proteines membranaires, ont revele plusieurs bandes proteiques de haut poids moleculaire confortant l'existence d'une famille de genes chs, comme chez les champignons chitineux. Dans des fractions enzymatiques actives, un polypeptide de 60 kda, sedimente lors de la synthese in vitro de la chitine et un peptide de 37 kda, isole d'une fraction membranaire solubilisee, ont ete immunodetectes. Ils peuvent representer des formes tronquees mais fonctionnelles de l'enzyme. L'expression heterologue du peptide de 37 kda chez une levure chs a ete realisee afin de verifier que seulement 37 kda suffisent pour avoir une activite chs. Un systeme de transformation de s. Monoica a ete realise afin d'analyser le role morphogenetique du gene chs2. La diploidie de s. Monoica ne permet pas l'utilisation de la technique d'interruption genique, appliquee chez les champignons superieurs haploides. L'inactivation du gene chs2 a alors ete realisee par la technique d'arn antisens. Les transformants n'ont pas presente d'alteration dans leur morphogenese ou dans l'activite globale chs, indiquant que ce polymere parietal n'a pas de role morphogenetique fondamental