Abstract FR:

Bordetella pertussis est une bactérie à Gram négatif. Son enveloppe est formée par une membrane cytoplasmique et une membrane externe, les deux étant séparées par le compartiment périplasmique aqueux. Ce sont autant d'obstacles que doit franchir la FHA pour se retrouver dans le milieu extérieur. La FHA est sécrétée par l'une des six voies de sécrétion connues chez les bactéries à Gram négatif, la sécrétion à deux partenaires ou TPS (« two- partner secretion »). La voie TPS est classiquement associée à la sécrétion de protéines de virulence chez de nombreux pathogènes, notamment Haemophilus influenza, Erwinia chrysanthemi, Yersinia pestis, etc. Le premier partenaire de cette voie est la protéine sécrétée, de la famille TpsA, ici la FHA. Le protéines TpsA sont très grandes en taille, supérieure à 100 kDa, et ce sont en général des adhésines ou hémolysines. Elles possèdent toutes un domaine N-terminal caractéristique d'environ 300 résidus appelé le « domaine TPS ». Ce domaine est essentiel à la sécrétion et chez plusieurs protéines TpsA, on y a trouvé des résidus importants pour la sécrétion. Chaque protéine TpsA possède un transporteur dédié, de la famille TpsB, dont les membres formeraient des canaux dans la membrane externe. Il n'est toujours pas clairement établi si la sécrétion se fait par le pore individuel de la protéine TpsB, ou bien s'il se produit une oligomérisation de TpsB et la protéine TpsA passerait par le canal central ainsi formé. Le partenaire TpsB de la FHA est appelé FhaC. La FHA est produite dans le cytoplasme sous forme d'un très grand précurseur de 360 kDa, appelé FhaB. Grâce à son peptide signal N-terminal, FhaB est reconnu et exporté dans le périplasme par la machinerie Sec, où une signal-peptidase de type Lep clive le peptide signal. Une fois dans le périplasme, FhaB semble conserver une conformation non repliée puisque dans les extraits périplasmiques, le précurseur est retrouvé dans la fraction insoluble. Le passage de la membrane externe se fait via FhaC qui vraisemblablement reconnaît FHA au niveau de la face périplasmique de la membrane externe et assure ensuite sa translocation vers l'extérieur. A la surface de la bactérie, la protéase SphB1 clive FhaB en libérant ainsi dans le milieu la FHA mature de 220 kDa. La plus petite portion sécrétable de la FHA, qui contient donc le signal de sécrétion au complet, correspond aux 30 kDa du côté N-terminal et a été nommée Fha30. Cette région correspond principalement au domaine TPS. Nous avons entamé une analyse plus approfondie du domaine TPS pour identifier le signal de sécrétion de la FHA afin d'établir un modèle qui pourrait servir pour toute la famille de protéines TpsA. Nous avons obtenu en 2004 la première structure cristalline d'une protéine de la famille TpsA, celle de Fha30. Cette structure nous a permis de voir que le domaine TPS formait une hélice beta droite à section transversale triangulaire avec quatre brins beta anti-parallèles extra-helicaux. Etant donné que les prédictions de structure secondaire indiquent que la FHA contient tout le long une série de répétitions prédits en brins beta, l'hélice beta observée sur Fha30 se prolonge vraisemblablement dans la partie centrale de la FHA. La structure nous a permis de voir que le domaine TPS s'étendait environ 100 résidus plus loin que ce que l'on croyait jusque là, ce qui nous a amené à élargir notre zone de recherche pour l'identification du signal de sécrétion de la FHA. Le domaine TPS est composé d'une alternance de régions non conservées et conservées LC1-C1-LC2-C1 (pour « conserved » et « less conserved ») qui s'étendent jusqu'à 250 résidus environ du N-terminus. Pour trouver les résidus faisant partie du signal de sécrétion, un grand nombre de mutations ponctuelles ou de délétions correspondant aux brins ne faisant pas partie de l'hélice beta, ont été introduites dans le domaine TPS et leur effet sur la sécrétion a été testé chez B. Pertussis. Nous avons utilisé Fha30 comme modèle de la protéine complète, puisqu'elle comporte vraisemblablement le signal de sécrétion entier. Un certain nombre de mutations dispersées dans le domaine TPS a permis d'abolir ou de diminuer la sécrétion, y compris les deux délétions. Pour pouvoir attribuer cet affet à un problème d'interaction avec le transporteur, nous avons mis au point un test d'interaction. Par la technique de co-précipitation (« pull down ») on observe cette interaction, mais uniquement lorsque Fha30 se trouvait dans une conformation non repliée. Pour ensuite identifier les résidus du domaine TPS impliqués dans la reconnaissance par FhaC et pouvoir tester un nombre élevé de mutants du domaine TPS, j'ai mis au point des conditions pour observer l'interaction avec FhaC par une technique d'interaction sur membrane (« far-western blotting » ou overlay). Les formes mutées de Fha30 produites dans le cytoplasme (qui n'ont donc pas encore vu le trasporteur) étaient non solubles, indiquant leur état non natif, donc semblable à celui de l'état supposé de la FHA dans le périplasme. Grâce au far-western blot, j'ai pu identifier plusieurs résidues capables de réduire l'efficacité de reconnaissance de Fha30 par FhaC. Le signal de sécrétion de FHA est composite puisque certains résidus sont conservés entre les protéines TpsA et d'autres ne le sont pas, ce qui peut rendre compte de la spécificité entre chaque transporteur TpsB et sa protéine TpsA. De plus, certains résidus lorsqu'ils étaient mutés étaient capables d'abolir la sécrétion de FHA alors qu'ils n'étaient pas impliqués dans l'interaction avec FhaC. Nous pensons qu'ils auraient plutôt un rôle structural, c'est à dire dans le repliement et/ou dans la stabilisation de la structure native de la FHA. Ainsi, le domaine TPS aurait deux fonctions : interaction avec FhaC et rôle structural important. Etant donné la conformation périplasmique non native de la FHA, nous avons émis l'hypothèse que des protéines telles que des chaperons périplasmiques pourraient protéger l'intermédiaire périplasmique contre la dégradation avant que la translocation via FhaC n'ait lieu. Plusieurs candidats ont été identifiés et ils ont la capacité d'empêcher l'agrégation de la Fha30 in vitro. L'un de ces candidats est une chaperon-protéase qui est essentielle à la sécrétion de la FHA. De plus, c'est uniquement son activité chaperon qui est importante pour la sécrétion de la FHA. Alors que la partie N-terminale de FhaC est importante pour l'interaction avec la FHA, des études de conductance sur FhaC, effectués avec Albano Méli au CBS de Montpellier, sur une série de mutants de FhaC ont montré que FhaC formait un canal perméable aux ions, et que sa partie C-terminale est suffisante pour former ce canal. Il existe une certaine corrélation entre l'activité de sécrétion de la FHA et les propriétés canal de FhaC, ce qui pourrait indiquer que la FHA emprunterait le canal présent dans le monomère FhaC pour traverser la membrane.