Abstract FR:

Suite a la description de l'importante heterogeneite genetique associee au virus de l'immunodeficience humaine de type 1, nous nous sommes interesses aux mecanismes a l'origine de cette variabilite. L'hypermutation de type g->a, qui correspond a la substitution de 15 a 60 % des residus guanines en adenines de certains genomes retroviraux, a pu etre reproduite in vitro, pour le vih-1, par l'utilisation de la transcriptase inverse du vih-1, dans des conditions de concentrations biaisees en dntps. Au cours de cette these, nous avons montre que la variation des concentrations nucleotidiques pouvait influencer la formation des deletions in vitro, lors de la retrotranscription, mais aussi la fidelite de la synthese d'un arn a partir d'une matrice adn in vitro, soit le processus inverse de la retrotranscription, qui represente une des etapes du cycle de multiplication des retrovirus. L'etablissement des conditions a l'origine de la variabilite a permis de developper des methodes de mutagenese des acides nucleiques in vitro tres efficaces. Dans le but de developper une technique de mutagenese performante et experimentalement simple a realiser, l'utilisation d'un derive de base purique, le dytp, lors de la reaction de polymerisation en chaine, a permis de generer des sequences aleatoirement mutees, avec des taux de mutations de 5x10#-#2 par base par reaction et un spectre de mutations variees. Les methodes d'hypermutagenese ont ensuite ete appliquees a l'etude de l'evolution in vitro d'une petite proteine bacterienne : la dihydrofolate reductase r67. Cette enzyme constituait un modele rapide et techniquement ideal, qui a permis de montrer la puissance des methodes dont nous disposons, pour apprehender le potentiel evolutif d'une proteine in vitro. Nous avons ainsi montre la faisabilite d'une telle approche dans le but de l'appliquer a l'evolution in vitro des proteines du vih-1.