Abstract FR:

Pour aborder l'etude des mecanismes qui regissent l'expression genetique dans les cellules de carcinome embryonnaire (ce) f9, nous avons developpe deux approches fonctionnelles pour identifier des elements cis-regulateurs specifiquement actifs dans ces cellules ou au cours de leur differenciation. Premiere approche : etude de la regulation du gene oct-4 le gene oct-4 est, a ce jour, le seul gene codant pour un facteur de transcription dont l'expression est restreinte aux cellules totipotentes de l'embryon in vivo et aux cellules de ce in vitro. En utilisant la strategie du piege a amplificateur ciblee au locus oct-4, nous avons identifie plusieurs elements regulateurs disperses dans le locus dont l'activite est specifique aux cellules f9 mais pas a leurs derives differencies l'endoderme parietal, ni les lignees cellulaires differenciees comme l et hela. La caracterisation des deux regions les plus actives, qui se trouvent en amont du gene dans la region distale, a permis de demontrer la presence d'un amplificateur extremement actif et d'un regulateur unidirectionnel. Dans les cellules f9, l'amplificateur est au moins 12 fois plus actif que le regulateur unidirectionnel et 20 fois plus que le promoteur oct-4 ainsi que 2 fois plus actif que les amplificateurs des virus rsv, cmv, et 5 fois plus que celui du virus sv40. En parfaite correlation avec leur activite tissu-specifique, ces deux elements interagissent avec des facteurs differentiellement exprimes dans les cellules f9 et leurs derives differencies. La determination des sites d'interaction avec les facteurs specifiques aux cellules f9 a montre que l'amplificateur est compose de quatre sous-elements et le regulateur de deux. De maniere surprenante, l'un des elements de l'amplificateur contient une sequence octamere qui lie preferentiellement la proteine oct-4 et tres peu oct-1, a l'inverse de l'octamere canonique. En outre, cette sequence participe pour une grande part a l'activite de l'amplificateur, demontrant ainsi que cet amplificateur est autoregule. Les trois autres elements ne contiennent aucun motif de liaison correspondant a un facteur de transcription connu, indiquant que les facteurs interagissant avec ces sequences sont de nouveaux facteurs de transcription. Par ailleurs, l'un des elements du regulateur unidirectionnel contient un motif gata et pourrait, par consequent, lier un nouveau facteur de transcription de la famille gata dont aucun membre connu n'est exprime dans les cellules f9. L'autre element pourrait lier un facteur apparente au facteur elp qui est exprime specifiquement dans les cellules f9. Seconde approche : analyse du promoteur de la vimentine l'expression du gene vimentine, qui est exprime dans la plupart des cellules in vitro quelque soit leur origine, est controlee par des elements regulateurs multiples disperses sur une longue distance en amont du gene. En utilisant le promoteur vimentine comme sonde pour identifier des elements regulateurs dont les activites different entre les cellules f9 et les cellules f9 en cours de differenciation traitees par le ramp pendant 24 h, nous avons mis en evidence deux regions, une proximale (140/78) et une distale (1710/957), dont les activites ont augmente de maniere significative. L'augmentation d'activite de la region distale est due a la presence de plusieurs sites contigus de liaison de l'homeoproteine hox-a5. Ces motifs interagissent avec des facteurs exprimes au cours de la differenciation dont certains pourraient etre hox-a5 et son paralogue hox-b5. En effet, hox-a5 interagit in vitro de maniere specifique avec ces sites et forme un patron de protection de la digestion par la dnase i similaire a celui forme avec ces facteurs. En outre, hox-b5 transactive la region distale in vivo. Quant a la region proximale, elle contient une sequence au niveau du brin non codant interagissant avec un (ou des) facteur(s) affine a l'adn simple brin. L'expression de ce facteur ne varie pas avec la differenciation, ce qui indique que l'activation de cette region n'est pas due a l'apparition de nouveaux activateurs.