Abstract FR:

La calmoduline (cam) joue un role fondamental dans la transmission des signaux calciques intracellulaires. La fixation du calcium a cette proteine se traduit par un changement conformationnel qui lui permet alors d'interagir specifiquement avec une ou plusieurs de ses nombreuses proteines cibles. Nous montrons que l'heme est une sonde directe de l'etat actif de la cam, et de ses interactions avec ses nombreux peptides ou proteines cibles. En presence de calcium, la cam fixe quatre molecules d'heme-co avec une affinite (kd) moyenne de 1 m. Les etudes de photodissociation par eclair laser de ce complexe montre une vitesse de recombinaison tres elevee du co a l'heme (10#1#0 s##1) ainsi qu'un environnement local relativement enfoui des sites de fixation de l'heme-co suggerant que ces sites pourraient etre les deux poches hydrophobes observees dans la structure cristallographique. La methode de transfert d'energie de fluorescence entre l'heme-co et les tyrosines de la cam native ou les tryptophanes de cams modifiees par mutagenese dirigee montrent que la fixation de l'heme-co a la cam suivrait un modele de cooperativite deux a deux au niveau de chaque poche. L'hemine-cn est utilisee comme sonde de l'interaction de la cam avec ses peptides cibles tels la melittine, le baa17 et le mastoparan ou avec une proteine cible entiere telle l'atpase (ca#2#+mg#2#+) erythrocytaire. En effet, elle fixe les peptides cibles de la cam avec une forte affinite (kd=0. 1 a 1 m), mais ne fixe ni la cam ni le complexe peptide*cam. La fixation de l'hemine-cn a ces peptides se traduit par une extinction de la fluorescence du tryptophane de ces peptides. L'addition de cam a ce complexe provoque le relargage de l'hemine-cn en raison de la plus forte affinite du peptide pour la cam (kd=1 nm) et se traduit par une reaugmentation de l'emission de la fluorescence caracteristique du complexe peptide*cam. L'heme est donc a la fois une sonde conformationnelle de certaines proteines, et un nouvel outil d'etude des interactions proteine*proteine