Abstract FR:

Nous avons etudie deux aspects de la carboxylation catalysee par la vitamine k. Le role du cofacteur a ete aborde par l'etude de l'incorporation et la localisation d'oxygene (#1#8o#2) au niveau de l'epoxyde de la vitamine k produit, a l'aide d'echantillons enrichis specifiquement. Apres optimisation des conditions experimentales (incorporation #1#8o#2 et extraction des produits), nous avons mis au point les conditions de sm/sm qui doivent permettre de mener l'analyse a son terme. En parllele, nous avons entame l'etude du site actif par marquage irreversible. La premiere tentative, basee sur la preparation d'analogues fluores de la vitamine k n'a pas permis de conclure. L'une des molecules cibles n'est pas un inhibiteur irreversible de l'enzyme, alors que la synthese de son isomere s'est heurtee a des problemes de stabilite d'un synthon intermediaire de la synthese (aldehyde alpha fluore). C'est finalement a l'aide de photomarquage que nous avons obtenu un marquage efficace du site actif: nous avons realise la synthese enantioselective d'un acide amine photoactivable (p-benzoyl ophenylalanine) et l'avons incorpore dans plusieurs sequences peptidiques analogues des substrats de la carboxylase. L'un de ces peptides photoactivables permet d'obtenir 90% de marquage de la proteine. Nous avons quantifie ce marquage a 60% au niveau du domaine n terminal (1 a 349) et 40% au niveau de la partie c terminale de la carboxylase. L'etude menee sur le domaine c terminal nous a permis de mettre en evidence une zone de 40 acides amines impliquee dans ce marquage, correspondant aux residus 423 a 462