Développement d'outils chimiques pour l'élucidation de la voie du 2-C-méthyl-D-érythritol 4-phosphate pour la biosynthèse des isoprénoi͏̈des
Institution:
Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
During this work, we brought chemical tools to advance in the study of the biosynthesis of isoprenoids according to the MEP pathway. This field of research simultaneously combines the chemistry of polyfontionnalized molecules labelled by stable isotope like deuterium or radioactive like tritium, molecular biology and enzymology. The carbohydrate chemistry and the use of D-tartrate derivatives enabled us to obtain 2-C-methyl-D-erythritol (ME) and its 4-phosphate (MEP), free 1-deoxy-D-xylulose (DX) and its 5-phosphate (DXP). All approaches provide these intermediates in an optically pure form and offer labelling possibilities on strategic positions. The incorporation of tritium labelled ME in a mutant of Escherichia coli accumulating ME 2,4-cyclodiphosphate, is the proof of the effectiveness of combination of the chemical and the genetic tool. Such dual approach finally led to the quasi complete elucidation of the MEP pathway. Knowledge of the intermediates and the enzymes implied in the pathway opens new way for the development of new antimicrobial agents leading us to interest in the mechanism of the DXP isomero-reductase, the second enzyme of the MEP pathway. Independently, the C-4 position of the DX is the key to determine the presence of two ways leading separately to IPP and DMAPP. Furthermore, tobacco BY-2 cells were an adapted biological system for the study of this branching point in plants. For this, we developed a synthesis of optically pure [4-2H]-DX, which was incorporated into the plastidic isoprenoids of the tobacco BY-2 cells. Such an experiment pointed out the presence of a branching point in the MEP pathway in plants
Abstract FR:
Au cours de ce travail, nous avons apporté des outils chimiques pour avancer dans l'étude de la biosynthèse des isoprénoi͏̈des selon la voie du MEP. Ce domaine de recherche regroupe à la fois la chimie des molécules polyfonctionnalisées marquées par un isotope stable comme le deutérium ou radioactif comme le tritium, la biologie moléculaire et l'enzymologie. La chimie des sucres et l'utilisation des dérivés du D-tartrate nous ont permis d'obtenir le 2-C-méthyl-D-érythritol (ME) et son 4-phosphate (MEP) ainsi que le 1-désoxy-D-xylulose libre (DX) et son 5-phosphate (DXP). Toutes les approches fournissent ces intermédiaires optiquement purs et offrent des possibilités de marquages sur des positions stratégiques. L'incorporation de ME marqué au tritium dans une souche mutée d'Escherichia coli accumulant du ME 2,4-cyclodiphosphate est la preuve de l'efficacité du brassage de l'outil chimique et génétique. Cette conjugaison a finalement conduit à l'élucidation quasi complète de la voie du MEP. La connaissance des intermédiaires et des enzymes dans cette voie de biosynthèse d'isoprénoi͏̈des ouvre une porte sur la découverte et le développement de nouveaux agents antibactériens ou antiparasitaires. Ainsi, nous nous sommes intéressés à étudier le mécanisme de la DXP isoméro-réductase. Indépendamment, des expériences d'incorporation chez E. Coli de ME marqué au deutérium ont montré l'existence de deux chemins différents menant séparément à l'IPP et au DMAPP. La position C-4 du DX est la clé pour déterminer la présence de ces deux voies. De plus, des cellules BY-2 de tabac ont été un système biologique approprié pour l'étude du branchement chez les plantes. C'est pourquoi dans premier temps nous avons développé et conçu une synthèse de [4-2H]-DX optiquement pur. Dans un second temps, nous avons analysé l'incorporation de ce marquage dans les isoprénoi͏̈des plastidiques des cellules de tabac et montré la présence d'un branchement dans la voie du MEP chez les plantes