Abstract FR:

Cette these comporte trois aspects concernant les enzymes impliques dans la biosynthese et l'utilisation du carbamylphosphate chez l'archaebacterie hyperthermophile et barophile pyrococcus abyssi. Dans un premier temps nous avons purifie et caracterise la carbamylphosphate synthetase (cpsase) de ce microorganisme. Cet enzyme est unique pour les voies de biosynthese de l'arginine et des nucleotides pyrimidiques. Son poids moleculaire est particulierement reduit par rapport aux enzymes homologues (environ 47 000 au lieu de 120 000). Il est actif sous forme de monomere et utilise uniquement l'ammonium comme donneur de groupement amine. L'activite de cette cpsase est sensible a des effecteurs allosteriques, presentant uniquement une inhibition par les derives nucleotidiques triphosphates a l'exception du gtp et pas de stimulation par les activateurs des cpsases. L'inhibition semble competitive par rapport a l'atp, ce qui n'exclut pas l'existence de site(s) regulateur(s). L'enzyme presente une thermostabilite remarquable ; toutefois, les hautes pressions ont un leger effet negatif sur sa stabilite et sur son activite. Une serie de proprietes cinetiques de cet enzyme le distingue des carbamates kinases, suggerant qu'il represente une forme ancestrale des carbamylphosphate synthetases. La deuxieme partie du travail concerne l'etude de l'aspartate transcarbamylase (atcase) de p. Abyssi. L'enzyme presente des phenomenes de cooperativite entre les sites catalytiques pour ses deux substrats. Contrairement aux enzymes homologues, cette atcase n'est pas inhibee par les analogues du carbamylphosphate, ce qui suggere une configuration ou une accessibilite particuliere du site de fixation de ce substrat. L'atcase de p. Abyssi est soumise a la regulation allosterique: elle est activee par l'atp et retroinhibee par le ctp et l'utp. A l'exception du ctp, cette sensibilite est dependante de la temperature. La thermostabilite ainsi que la stabilite sous haute pression de l'atcase de p. Abyssi sont tres elevees. La purification partielle de cet enzyme entraine la perte de certaines de ses proprietes de regulation homotrope et heterotrope. Dans la troisieme partie de cette these nous avons mis en evidence l'existence d'une canalisation du carbamylphosphate entre les sites catalytiques de la cpsase et ceux de l'atcase et de l'ornithine transcarbamylase (otcase) chez p. Abyssi. Le phenomene a ete mis en evidence a l'aide des experiences de dilution isotopique et de cinetique de reactions couplees et verifie par les criteres cinetiques proposes par ovadi. Son role n'est pas de favoriser une des voies metaboliques de l'arginine ou des nucleotides pyrimidiques, mais probablement de proteger le carbamylphosphate, intermediaire tres instable. C'est, de plus, la premiere fois que la canalisation du carbamylphosphate vers la voie de biosynthese de l'arginine a ete mise en evidence. Cette canalisation est imparfaite et semble avoir lieu lors d'une association transitoire de ces enzymes lors de la catalyse. Aucune des conditions experimentales de temperature ou de presence de substrats n'ont permis de mettre en evidence cette association transitoire entre les enzymes de couplage