Stratégies de modification du génome des mammifères
Institution:
Paris 7Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
In this study, we describe strategies of modification of the mammalian genome. We try to facilitate the obtention of transgenic mice and to optimize transgene expression. Variable transgene expression among transgenic unes occurs due to random integrations of incoming DNA with in chromosomal elements at the integration site. Using a reporter gene, we try to identify sites permissive for renal transgene expression and to use them for introduction of genes of interest by homologous recombination. Pre-selection of permissive genomic sites can be useful to improve the repeatability of transgene expression in mouse models. Gene targeting is a very powerful tool to specifically modify the mouse genome. Until now, the use of ES cell is necessary to select this rare event. Using the meganuclease I-SceI, which induces a double-strand break in a defined locus, homologous recombination frequency can be stimulate at least 100-1000 fold in ES cell. We try to apply this strategy to induce homologous recombination in mouse zygotes. The success of this method will be very helpful in facilitating obtention of mouse models with targeted modifications. Another goal is to develop a cortical collecting duct cell fine that allows inducible gene expression using the tetracycline-inducible system (Tet-On). We designed several strategies aimed at the development of tight and highly inducible system. Analysis of reporter gene expression demonstrated that the Tet-On system is suitable for inducible gene expression in these cells: induction of expression is rapid and fully reversible when Dox is withdrawn. This strategy should be useful in establishing inducible gene expression in other cell types. In the last part of this work, we took advantage of the inducible tetracycline cellular clone already characterized to perform somatic homologous recombination. Using this strategy we were able to target genes of interest in the inducible locus. The transgene maintened inducible expression. Gene targeting in somatic cells represents a potentially powerful method for gene therapy and to obtain transgenic animais by nuclear transfert.
Abstract FR:
Ce travail de thèse est centré sur la modification du génome chez les mammifères, en utilisant comme modèle la souris. Nous avons abordé l'optimisation de l'expression de transgènes ainsi que la facilitation de l'obtention des souris transgeniques. En effet, la transgénèse additionnelle conduit à une variabilité d'expression des transgènes, liée au caractère aléatoire de l'intégration. Nous avons donc cherché dans le génome la présence de sites dits permissifs, c'est-à-dire qui permettent une expression correcte des transgènes. L'identification de tels sites facilitera l'obtention de souris transgenique avec une expression prédictible. Un autre aspect de ce travail a consisté à mettre au point les conditions pour la recombinaison homologue dans l'ovocyte fécondé de la souris. En effet, nous avons mis à profit une technique qui permet d'améliorer considérablement le taux d'obtention de l'événement de recombinaison homologue (stratégie I-SceI dans les cellules ES afin de l'appliquer à l'ovocyte de souris et faciliter ainsi l'obtention de souris génétiquement modifiées. Dans le cadre de l'optimisation de l'expression des gènes, nous avons utilisé un système d'expression conditionnelle (système tétracycline), que nous avons amélioré en facilitant le criblage des clones ayant une bonne expression. Nous avons démontré que le système Tet-On est fonctionnel dans une lignée de cellules qui dérive du canal collecteur de rein de rat (RCCD1), que l'induction est rapide et complètement réversible. Cette stratégie peut être appliquée à d'autres lignées cellulaires. Ces clones cellulaires ont été utilisés pour l'expression conditionnelle de transgènes d'intérêt et on permis de valider la technique de recombinaison homologue somatique dans des cellules hautement différenciées. La recombinaison homologue dans les cellules somatiques est une méthode potentiellement très puissante pour des applications en thérapie génique et pour l'obtention d'animaux génétiquement modifiés par transfert nucléaire.