Abstract FR:

Les petites proteines g de la superfamille ras sont des molecules de 20 a 30 kda qui sont actives lorsqu'elles sont liees au gtp, et sont inactives quand elles sont liees au gdp. Nous avons montre que la petite proteine g rhoa est impliquee dans les mecanismes de cytotoxicite a mediation cellulaire. Grace a l'utilisation d'une adp-ribosyltransferase qui bloque specifiquement les fonctions des proteines rho, nous avons observe une inhibition de la lyse de cellules cibles par des lymphocytes cytotoxiques nk ou ctl. Nous avons egalement demontre que le seul substrat adp-ribosylable dans ces cellules est rhoa. Sachant que les proteines rho regulent l'organisation du cytosquelette, nos resultats suggerent que l'inhibition de la cytotoxicite par la transferase est due soit a une inhibition du relarguage polarise des granules cytotoxiques, soit a une inhibition des contacts effecteurs/cibles medies par les molecules d'adhesion. Afin d'etudier precisement la fonction et la regulation de rhoa, il nous a fallu developper une serie d'outils specifiques de rhoa. Outre le developpement de proteines de fusions gst-rhoa, nous avons genere des mutants de rhoa dans lesquels nous avons substitue une alanine a la serine 188. Nous avons egalement produit un anticorps monoclonal anti-rhoa, capable de discriminer rhoa de tous les autres membres de sa famille (en particulier de rhob et rhoc, qui sont homologues a 95% de rhoa). Cet anticorps nous a permis de localiser, par western-blot 95% de rhoa dans le cytosol d'une serie de lignees cellulaires non activees, alors que les fractions membranaires de ces memes cellules expriment 5% de rhoa. Mais cet anticorps anti-peptide n'immunoprecipite rhoa que dans des conditions de denaturation partielle (ce qui empeche l'etude des molecules associees a rhoa, ainsi que l'etude de ratio gdp/gtp). L'activation de la cytotoxicite est modulee par un ensemble de facteurs de croissance, en particulier par les interleukines. Etant donne que rhoa participe a cette fonction, nous nous sommes interesses a la regulation de cette gtpase en reponse a de tels signaux. Au cours de ces travaux, nous avons ete frappe du parallele entre les effets de c3 transferase et de l'ampcyclique, aussi bien au niveau de la fonction cytotoxique, qu'au niveau de la morphologie des cellules ou de leur motilite. Ces effets, superposables dans d'autres systemes cellulaires, nous ont conduit a analyser les sequences de rhoa. Nous avons ainsi detecte en position c-terminale, une sequence cible de la proteine kinase a. Grace a l'utilisation des proteines de fusions et des mutants ser-, nous avons montre in vitro, que rhoa est phosphorylable par la proteine kinase a, sur la serine 188. A partir des cellules, nous avons ete capable d'immunoprecipiter rhoa phosphorylee uniquement a partir de fractions membranaires soumises a l'action de sous unite catalytique de pka et de -atp (la fraction cytosolique n'est pas phosphorylee car complexee au facteur d'echange rhogdi). In vivo, en reponse au bt2camp, des cellules de la lignee yt transloquent (de facon transitoire) rhoa des membranes vers le cytosol. Ces experiences combinees a d'autres, nous ont permis de voir que si la phosphorylation de rhoa membranaire (qui est majoritairement liee au gtp) etait necessaire a la translocation, elle n'etait pas suffisante, et qu'un facteur cytosolique intervenait pour decrocher rhoa phosphorylee. Nos experiences indiquent que rhogdi est ce facteur. Cela nous permet de decrire un nouveau mecanisme de regulation de rhoa en reponse a une stimulation par l'ampc. Cette regulation de rhoa permet ainsi d'expliquer la rapidite par laquelle une cellule cytotoxique peut adherer a une cellule cible, degranuler, et se detacher de celle-ci afin de lyser une nouvelle cible