Abstract FR:

La phosphoglycerate kinase de levure (ypgk) est une proteine monomerique composee de deux domaines structuraux continus. Les interactions entre les deux domaines impliquent l'helice v qui relie les domaines et les helices c-terminales xiii et xiv qui interagissent avec le domaine n. Afin de chercher l'existence des interactions cles entre ces domaines et de determiner leur role dans le repliement et la stabilite de cette proteine nous avons construit une proteine tronquee de ses 12 residus c-terminaux (ci-incluse l'helice xiv), la ypgk 404-415. Cette proteine se replie dans une conformation tres similaire a celle de la ypgk sauvage, mais elle presente une activite tres faible, une augmentation de la flexibilite de la proteine entiere et une stabilite diminuee. La faible activite de la ypgk 404-415 peut augmenter 40 fois apres l'addition du peptide complementaire 404-415. Des etudes trnoesy ont montre que ce peptide, qui n'est pas structure en solution, se replie dans une structure helicoidale dans la region 405-410. Cette helice semble correspondre a la position de l'helice xiv dans la ypgk sauvage determinee par les etudes cristallographiques. Il semble que la partie c-terminale n'est pas necessaire pour les etapes precoces de repliement, mais elle sert de verrou entre le domaine n et le domaine c permettant l'expression de l'activite enzymatique. Cependant, les etudes portees sur une proteine permutee circulairement qui possede toute la sequence de la ypgk (avec les nouvelles extremites en positions 404 et 403) indiquent que le role decisif pourrait etre attribue au lien covalent entre les residus 403 et 404, donc entre l'helice xiii et l'helice xiv, les interactions entre l'helice xiv et le domaine n etant moins importantes. Afin d'etudier le role de la continuite des domaines dans le processus de repliement de la ypgk, deux proteines permutees circulairement au niveau de chaque domaine ont ete construites, surexprimees et purifiees. Elles sont capables de se replier efficacement dans une conformation active avec des legers changements dans les structures secondaire et tertiaire correles avec un certain degre d'heterogeneite dans l'etat natif. Meme si ces proteines possedent une stabilite diminuee, leur capacite a se replier n'est pas fondamentalement affectee. La continuite des domaines peut etre donc importante pour la stabilite de la proteine, mais n'est pas necessaire pour que la ypgk puisse atteindre une structure native, fonctionnelle. Le repliement in vivo d'une de ces proteines est tres sensible aux conditions energetiques ou a un autre facteur limitant offerts par le milieu de culture. Selon ces conditions, les cellules de levure sont capables de produire une proteine metastable ou une proteine stable. La difference entre ces deux types de proteines semble de nature conformationnelle, mais tres locale due probablement a un demarrage incorrect de la formation de la structure. Ce demarrage pourrait etre du aux perturbations dans le cycle des reactions des molecules hsp70 ou hsp60. La destruction de la continuite des domaines n'a pas d'effets drastiques sur le chemin de repliement de la proteine. Les etapes precoces sont legerement alterees suggerant l'existence des chemins paralleles alternatifs de repliement