Abstract FR:

Ces dernieres annees, les archaea hyperthermophiles (thermococcales) ont ete plus particulierement etudiees pour leurs enzymes thermostables. Cependant, les etudes genetiques de ces microorganismes sont limitees par le manque d'outils genetiques (marqueurs de selection, systeme de transformation, vecteurs de clonage) fonctionnant a hautes temperatures. La decouverte d'un plasmide cryptique (pgt5) de la souche isolee recemment d'une source hydrothermale profonde, pyrococcus abyssi, a permis d'entreprendre des recherches visant a developper un systeme de transformation et a construire un vecteur de clonage. Notre contribution dans ce projet, a consiste tout d'abord a mettre au point un milieu minimum permettant une croissance de p. Abyssi avec des rendements et des taux de croissance similaires a ceux obtenus sur milieu riche. Ce milieu est compose de 9 acides amines : histidine, threonine, arginine, tyrosine, methionine, valine, phenylalanine, isoleucine et leucine. Des cmi de 14 antibiotiques ont egalement ete determinees pour p. Abyssi, des souches proches et differentes thermococcales. De bonnes thermostabilites et de basses frequences de mutation spontanee ont permis de selectionner l'acide fusidique et la puromycine comme les antibiotiques les plus prometteurs dans la recherche de marqueurs de selection chez les thermococcales. De plus, meme si des mutants de resistance a la puromycine ont pu etre isoles, la recherche de mutants auxotrophes pour l'uracil s'est averee la plus prometteuse, l'auxotrophie etant liee a la resistance a l'acide 5-fluoroorotique (5-foa). Apres mutation spontanee, et/ou mutagenese aux uv ou a l'ethylmethanesulfonate (ems), 9 mutants stables de p. Abyssi ont ete isoles et leur auxotrophie a ete confirmee. Des mesures enzymatiques ont montre que ces mutations se situaient dans les genes pyre et/ou pyrf, successivement impliques dans la voie de biosynthese des pyrimidines. Des experiences de complementation d'un mutant e. Coli (pyre-) avec une banque genomique de p. Abyssi, nous ont permis de cloner et de sequencer un fragment de 965pb possedant une origine de replication majeure de 165 codons correspondant au gene pyre de p. Abyssi. Ce gene pourrait representer un marqueur de selection potentiel utile tout d'abord dans l'elaboration d'un systeme de transformation, puis dans la construction d'un vecteur de clonage base sur pgt5.