Abstract FR:

La proteine nef est une proteine myristylee de 27 a 35 kda tres conservee dans les virus d'immunodeficience humaine de type 1 et de type 2 (vih-1 et vih-2) et leur homologue simien : le virus d'immunodeficience simienne (vis). C'est une proteine qui joue un role important dans la physiopathologie du sida. Elle est necessaire pour l'apparition du sida chez les macaques infectes et joue un role majeur dans la depletion des lymphocytes cd4+ par le vih. Plusieurs fonctions biochimiques de cette proteine ont ete decouvertes. D'une part, nef permet de maintenir l'infectivite optimale du virus et, d'autre part, elle perturbe differentes fonctions immunologiques de la cellule hote. Celles-ci sont representees par la perturbation de la transduction des signaux cellulaires et la diminution de l'expression membranaire des molecules impliquees dans les activites cles de la defense immunitaire, comme cd4 et cmh-i. La comprehension des mecanismes de ces fonctions requiert l'identification des proteines cellulaires qui interagissent avec nef. A l'aide de la technique de double hybride, nous avons identifie une nouvelle thioesterase humaine (hte) comme etant un partenaire cellulaire de nef de l'isolat lai du vih-1. Cette thioesterase presentant 42% d'homologie avec la thioesterase ii d'e. Coli est le prototype d'une nouvelle famille de thioesterases des eucaryotes. Les thioesterases sont des enzymes impliquees dans le metabolisme des lipides et la thio-acylation des proteines. Nous avons confirme la realite de l'interaction nef-hte par deux autres approches experimentales qui sont l'interaction in vitro et la co-immunoprecipitation dans les cellules lymphocytaires. Nous avons demontre que la proteine recombinante de hte presente une activite de thioesterase in vitro, qu'elle est capable d'hydrolyser les ponts thioester des acyl-coa de differentes longueurs de chaines carboniques (c6-c16). Hte porte a son extremite c-terminal un tripeptide skl. C'est un signal de ciblage appele pts1 (pour peroxisomal targeting signal 1) que l'on retrouve dans la plupart des proteines de la matrice peroxysomale. Nous avons demontre que hte interagit avec le recepteur qui reconnait le signal pts1 et que cette interaction est inhibee en presence d'un peptide portant le signal pts1. Ensuite, par des experiences en immunofluorescence, nous avons co-localise hte avec aldp (proteine de l'adrenoleucodystrophie) qui est une proteine peroxysomale dans les cellules hela. En utilisant la mutagenese aleatoire, nous avons genere et selectionne un mutant de nef defectif a la fois pour l'interaction nef-hte et pour l'une des fonctions de nef qui est la diminution de l'expression membranaire de cd4. Cette correlation suggere une implication de l'interaction nef-hte dans la diminution de l'expression membranaire de cd4 par nef. Ensuite, par l'approche de la mutagenese dirigee, nous avons identifie la mutation d123g de nef responsable de la perte de ces deux activites de nef. Nous avons demontre ensuite que plusieurs mutants de nef mutes dans les positions adjacentes de d123, comprenant les residus d108 a w124 sont egalement defectifs pour l'interaction nef-hte et la diminution de l'expression membranaire de cd4. Ceci suggere que la region etendue de d108 a w124 de nef est importante pour ces deux activites de nef. Nous avons demontre ensuite que le mutant nef d123g est defectif aussi pour deux autres activites de nef : l'augmentation de l'infectivite virale et la diminution de l'expression membranaire de cmh-1 (complexe majeur d'histocompatibilite classe i). Ces travaux permettent l'identification d'une nouvelle thioesterase humaine comme etant partenaire potentiel de neflai de vih-i et du residu d123 de nef important pour trois fonctions majeures de nef et pour l'interaction nef-hte. La correlation interaction-fonction etablie par les approches de mutagenese suggere une eventuelle implication fonctionnelle de hte dans les activites de nef.