Abstract FR:

Les beta-lactamines (penicillines et cephalosporines) representent la classe la plus utilisee des antibiotiques en therapie anti-infectieuse. Ces molecules agissent en inhibant irreversiblement une famille d'enzymes responsables de la synthese de la paroi chez les bacteries : les pbps (pour penicillin-binding proteins). Face au defi en sante publique que represente le developpement de nouvelles souches pathogenes resistantes a ces antibiotiques, la connaissance de l'organisation des pbps et de leurs mecanismes reactionnels constitue un element clef de la conception de nouveaux antibacteriens. La pbp1b d'escherichia coli a ete choisie comme modele des pbps de haut poids moleculaire de classe a pour cette etude. Cette enzyme catalyse deux reactions, dont l'une, la transglycosylation, est insensible a la penicilline alors que l'autre, la transpeptidation, est specifiquement inhibee par les -lactamines. Pour analyser l'organisation de ces deux domaines, une methode alternative a la mutagenese dirigee a ete mise au point. Celle-ci consiste a remplacer entre 5 et 6 residus d'une proteine par le meme nombre d'alanines, afin de comprendre le role structural et/ou fonctionnel de ces residus. Cette technique, ou ass (pour alanine stretch scanning) a pu etre validee avec succes sur la beta-lactamase tem-1 avant d'etre appliquee a la pbp1b. Combinee a une technique de detection in vitro de l'activite de fixation de la penicilline du domaine transpeptidase a l'aide d'un antibiotique fluorescent, et a une methode d'antibiogrammes selectifs determinant l'activite specifique in vivo d'un variant, l'ass a permis de mieux definir les limites des domaines catalytiques de la pbp1b, tout en soulignant l'importance de certains motifs conserves dans l'activite de celle-ci. Cette investigation a pu aboutir a la localisation d'une charniere entre le domaine transpeptidase et transglycosylase, permettant la production et la pre-purification d'un domaine transpeptidase soluble et actif.