Abstract FR:

Ce travail a consiste en la mise au point d'une technique de typage des alleles des genes hla-drb par biologie moleculaire en microplaque. Cette technique consiste en deux amplifications en chaine par polymerase realisees en paralleles et basees sur la segregation glycine/valine du codon 86 du second exon des genes hla-drb. Ces deux amplifications, s'excluant mutuellement, reduisent considerablement les indeterminations de typage en simplifiant l'interpretation. Les produits d'amplification biotinyles de l'echantillon sont repartis sur une demie microplaque et hybrides a des sondes oligonucleotidiques fixees aux puits par une liaison covalente et terminale. La detection de l'hybride biotinyle fait intervenir un conjugue sterptavidine-phosphatase alcaline, qui generera un produit fluorescent quantifiable. L'acquisition et l'interpretation des donnees sont realisees automatiquement par un logiciel de typage. Les sequences des 48 sondes ont ete optimisees en jouant sur leur taille et l'emplacement des mesappariements des sequences aspecifiques les plus proches. Grace a la complexite du systeme hla-drb, certaines regles, quant a la specificite relative de certains mesappariements, ont pu etre enoncees. Ce travail a conduit a la realisation d'une technique de typage hla-drb entierement automatisable, interpretation comprise. Ce typage est effectue en une seule serie d'experience contrairement aux autres techniques qui utilisent deux techniques en cascade et permet d'obtenir une resolution satisfaisante pour la plupart des echantillons. Le protocole est simple et permet d'obtenir un typage en 4 heures 30 une fois l'adn de l'echantillon extrait. Cette technique n'est pas restreinte aux genes hla-drb mais peut servir a tout autre locus