Abstract FR:

Mycobacterium tuberculosis, l'agent etiologique de la tuberculose, provoque plus de morts chaque annee que n'importe quelle autre bacterie pathogene. Cependant, les determinants genetiques de la virulence de cet organisme restent essentiellement inconnus, en partie car la genetique mycobacterienne est limitee par un manque d'outils de mutagenese. Il a ete jusqu'a present, extremement difficile de creer des mutations definies chez m. Tuberculosis : que ce soit par echange allelique ou bien par transposition. L'objectif de ce travail etait, a l'instar de ce qui avait ete decrit pour d'autres bacteries mieux caracterisees genetiquement, d'identifier un marqueur de contre-selection qui permettrait la selection positive des mutants resultant d'echange allelique. Nous avons montre que la levane-saccharase, produit du gene sacb de bacillus subtilis, etait toxique pour les mycobacteries en presence de saccharose. En consequence, sacb a ete utilise comme marqueur de contre-selection chez les mycobacteries et a permis la selection positive de mutants resultant d'echange allelique. D'autre part, nous avons construit une serie de vecteurs combinant les proprietes de selection d'une origine de replication mycobacterienne partiellement thermosensible et du gene sacb. Ces vecteurs sont tres efficacement perdus lorsque les deux pressions de selection sont appliquees simultanement. Ils ont ete utilises pour transferer is1096-km dans le chromosome de m. Bovis bcg et de m. Tuberculosis. Plusieurs centaines de milliers de mutants differents, dont la plupart resultaient d'evenements de transposition conservative, ont ainsi ete obtenus. Ces travaux ont permis de mettre au point des protocoles qui seront vraisemblablement utiles dans l'avenir pour l'identification des genes importants pour la protection antituberculeuse ou le developpement de la tuberculose maladie.