Abstract FR:

L'isocitrate deshydrogenase a nadp (icdh) catalyse la decarboxylation oxydative de l'isocitrate en -cetoglutarate, avec production de nadph. Chez les plantes superieures, une activite icdh a ete detectee dans differents organites (cytosol, chloroplastes, mitochondries, peroxysomes). Le role physiologique de ces isoenzymes demeure, pourtant, completement inconnu. L'isoenzyme cytosolique ayant ete purifiee a homogeneite, sa forte activite specifique relative ainsi que la presence dans le cytosol des cellules d'une activite aconitase ont contribue a formuler l'hypothese que cette isoenzyme pourrait avoir un role dans la fourniture des squelettes carbones necessaires au fonctionnement du cycle gs/gogat. En ce qui concerne le(s) role(s) des isoenzymes chloroplastique et mitochondriale, aucune d'entre elles n'avait jamais pu etre purifiee, ce qui rendait extremement difficile l'etude de leurs fonctions dans le metabolisme cellulaire. Dans le but de connaitre le role physiologique de chaque isoenzyme de l'icdh, nous avons tout d'abord decide de purifier les deux formes les plus abondantes (icdh1 et icdh2) a partir du meme extrait vegetal. Nous avons trouve que les suspensions des cellules de tabac renferment des activites icdh1 et icdh2 plus fortes que les feuilles de tabac; ceci nous a permis de mettre au point un protocole de purification des deux proteines a partir d'un meme extrait brut. Les masses moleculaires, parametres cinetiques et ph optimales des deux isoenzymes sont tres similaires; pourtant, elles peuvent etre distinguees sur la base de leurs profils d'elution differents d'une colonne echangeuse d'anions, leurs rf sur un gel natif d'acrylamide, leurs comportements au traitement avec la phosphatase alcaline, et leurs reactions aux anticorps diriges contre chaque isoenzyme. L'utilisation de ces anticorps nous a permis de mettre en evidence pour la premiere fois que l'isoenzyme majoritaire dans un extrait vegetal (icdh1) est localisee dans le cytosol de la cellule, et que l'isoenzyme icdh2 est chloroplastique. Nous avons ensuite construit une banque d'adnc a partir des suspensions de cellules de tabac; le criblage avec une sonde heterologue nous a permis d'obtenir trois differents clones codant pour l'icdh a nadp, aucun n'etant pleine longueur. Le fragment manquant du cote 5 du clone le plus represente dans la banque (le clone 16) a ete obtenu par pcr sur la banque d'adnc, en utilisant un oligonucleotide antisens synthetise a partir de la sequence de ce clone et un oligonucleotide sens propre de la banque. Une fois verifiee par sequencage l'identite entre le fragment amplifie (contenant l'extremite 5 manquante) et le clone 16, l'adnc pleine longueur a ete obtenu par ligation du fragment au 3 du clone 16, en utilisant un site de restriction interne. La correspondance entre l'un de nos clones (clone 16) et une des isoenzymes de l'icdh (l'isoforme cytosolique) a pu etre etablie par comparaison entre les sequences partielles de la proteine icdh1 purifiee a partir des feuilles de tabac et les sequences en acides amines deduites a partir des trois clones. Une approche similaire a aussi ete entreprise pour identifier le clone codant pour l'isoenzyme chloroplastique. Finalement, le clone 16 pleine longueur a ete clone dans deux vecteurs d'expression: ptrc99a et pet-8c. Parmi ces deux vecteurs, le systeme le plus performant en terme de rendement en proteine recombinante est sans nul doute le systeme pet-8c, ce qui nous a permis de verifier que les parametres cinetiques de l'icdh1 recombinante sont identiques a ceux de l'enzyme des vegetaux