Abstract FR:

Le cytosquelette microtubulaire, essentiel pour de nombreuses fonctions cellulaires est constitue de microtubules formes par l'assemblage polarise d'heterodimeres de tubuline / et nuclees in vivo au niveau des centres organisateurs des microtubules. La tubuline est une des rares proteines connues necessaire a la nucleation des microtubules. Les donnees concernant sa localisation cellulaire et son role physiologique dans la nucleation des microtubules sont nombreuses. Mais sa caracterisation biochimique a ete limitee par la difficulte d'obtenir de la tubuline monomerique soluble a partir de tissus, car elle ne represente que 0,01 % des proteines totales. Nous avons donc mis en oeuvre la surexpression de la tubuline dans differents organismes eucaryotes (cellules d'insecte, saccharomyces cerevisiae) et procaryotes (e. Coli). Elle a abouti a l'obtention de tubuline insoluble, malgre l'optimisation des conditions d'expression (temperature d'induction, presence de proteines chaperons ou d'additifs dans le milieu de culture, utilisation de differents partenaires de fusion). Nous avons alors developpe une methode de purification, par chromatographie d'affinite en conditions denaturantes, de la tubuline obtenue sous forme de corps d'inclusion dans e. Coli. Apres optimisation des parametres de renaturation, nous disposons de plusieurs mg de tubuline soluble purifiee. Cette tubuline recombinante n'hydrolyse pas le gtp, mais sa renaturation sur billes de gtp-agarose suggere qu'elle fixe le gtp. Le gtp semble se fixer de facon non echangeable sur la tubuline et la stabiliser. Il doit avoir un role au niveau de l'interaction de la tubuline avec la tubuline /, car seule la tubuline contenant du gtp interagit avec la tubuline /. Cette interaction avec la tubuline / suggere qu'il existe plusieurs formes de tubuline dans la cellule qui pourraient avoir differentes fonctions. De plus, la tubuline renaturee en presence de gtp forme des complexes de haut poids moleculaire dont la caracterisation permettra une meilleure comprehension du mecanisme de nucleation des microtubules et de la regulation de la dynamique du cytosquelette microtubulaire.