Abstract FR:

Ni l'introduction de genes dans les genomes mammiferes, ni le controle de leur expression ne sont actuellement completement maitrises. C'est a la resolution de ces deux problemes que contribue le travail presente ici. Les retrovirus utilisent pour s'integrer au genome une machinerie enzymatique qui leur permet de ne pas provoquer de remaniement de l'adn hote. Cependant, l'expression des genes transduits pose de nombreux problemes dus aux elements viraux des vecteurs. Ainsi, chez la souris, les cellules souches multipotentielles repriment de plusieurs facons l'expression des retrovirus et des vecteurs retroviraux. Nous montrons ici que leur expression ne peut se faire qu'a un nombre de sites d'integration extremement reduit et par un mecanisme original qui court-circuite tous les elements de regulations propres au virus. Cela confirme l'existence de facteurs cis dans le virus qui ont un effet represseur majeur. Il est probable que cette situation s'applique egalement aux autres cellules souches du soma. C'est ce qui nous a amenes a developper un nouveau type de vecteur retroviral dans lequel sont elimines tous les elements cis represseurs de la structure provirale. Ce nouveau type de vecteur exploite le systeme cre-lox du phage p1 pour aboutir a l'integration d'un ltr solitaire. Cette famille de retrovirus conserve tous les avantages d'une integration non mutagenique de copies uniques non remaniees dans le genome et assure le controle de l'expression des genes transduits. Outre l'integration au hasard de genes dans le genome, il est important aussi de pouvoir la cibler dans des sites predetermines. C'est ce que permet la recombinaison homologue. Nous avons developpe un systeme qui s'en inspire par ce qu'il utilise aussi une cassure de l'adn hote comme evenement initiateur mais qui s'en distingue parce qu'il est specifiquement induit par une endonuclease (i-sce i). I-sce i est codee dans l'adn des mitochondries de la levure saccharomyces cerevisi. Son site de reconnaissance et de clivage est de 18 pb. Le site de l'endonuclease a donc une faible probabilite d'etre present, meme dans les grands genomes. Le clivage d'un site i-sce i dans le genome peut etre present, meme dans les grands genomes. Le clivage d'un site i-sce i dans le genome peut etre exploite pour provoquer soit une deletion des sequences flanquantes, ou une recombinaison intra-chromosomique ou encore une reparation sur une molecule exogene presentant des homologies avec les sequences bordant de part et d'autre la cassure. L'interet majeur de ce systeme est qu'il permet d'introduire a un endroit predetermine du genome n'importe quelle sequence d'adn. Ce systeme est fonctionnel dans les cellules multipotentielles en culture, de plus, la mise au point de cette methode nous a permis de demontrer d'une maniere definitive que les cassures double brin sont recombinogeniques chez les mammiferes et que l'une des voies de la recombinaison homologue est la reparation de breche