Abstract FR:

L'objectif de ce travail consiste a mettre au point une strategie de mutagenese de la phosphatase alcaline d'escherichia coli (phoa) dans le but d'ameliorer ses proprietes catalytiques. Les formes modifiees de l'enzyme sont destinees a etre utilisees pour construire, par des methodes genetiques, des traceurs immunoenzymatiques performants. Dans un premier temps, nous avons transfere dans phoa le site catalytique d'une phosphatase alcaline de mammifere en remplacant quatre residus bacteriens par les acides amines correspondants des enzymes de mammiferes. Nous avons, de cette facon, genere une proteine chimere qui s'est revelee depourvue d'activite catalytique. Une mutagenese aleatoire a alors ete realisee sur le gene specifiant cette proteine dans le but de rechercher des revertants actifs de cette chimere. Nous avons ainsi identifie une mutation (330n) qui restaure l'activite de l'enzyme. Introduite dans phoa, cette mutation augmente de facon significative les proprietes catalytiques de la phosphatase. Combinee a la mutation d153h correspondant a un residu present dans les phosphatases de mammiferes, cette modification conduit a une phosphatase possedant une constante catalytique tres elevee. L'etude structurale par cristallographie aux rayons x de ce double mutant est en cours et permettra de comprendre le mecanisme moleculaire a l'origine de ce phenomene. Des traceurs immunoenzymatiques ont ete construits a partir de ces nouvelles enzymes afin d'evaluer les consequences des modifications realisees sur les performances des dosages. Les genes codant pour l'erabutoxine a, toxine extraite du venin du serpent laticauda semifasciata, et la proinsuline humaine ont ete inseres dans les genes codant pour les phosphatases modifiees. Les proteines, exprimees chez e. Coli a partir de ces constructions, sont homogenes. Leur utilisation comme marqueurs immunoenzymatiques dans des dosages par competition a permis de reduire jusqu'a un facteur 6 le temps necessaire a l'obtention d'un signal mesurable et d'augmenter la sensibilite du dosage par rapport aux tests realises avec des traceurs construits a partir de phoa. Ces travaux demontrent qu'il est possible, par des techniques d'ingenierie genetique, d'ameliorer l'activite d'une enzyme et de l'utiliser pour construire des traceurs immunoenzymatiques plus performants