Abstract FR:

La transition de denaturation-renaturation de la phosphoglycerate kinase de levure (ypgk) par le chlorure de guanidinium (gdn-hcl) a revele la presence d'un intermediaire de repliement dont l'intensite de fluorescence est superieure a la fois a la forme native et a la forme denaturee de la proteine. Deux mutants ne contenant qu'un seul des deux tryptophanes presents dans la proteine sauvage ont ete construits. Les proprietes catalytiques et physico-chimiques de ces mutants ne sont pas modifiees de facon significative, permettant la caracterisation de cet intermediaire hyperfluorescent a partir de leur etude. Il apparait que cet intermediaire correspond a une proteine denaturee depourvue de structure secondaire et tertiaire mais possedant des structures residuelles dans l'environnement des tryptophanes. Les structures residuelles presentes autour du tryptophane 308 semblent correspondre a un regroupement hydrophobe et sont compactes, tandis que celles presentes autour du tryptophane 333 sont plus dynamiques et semblent stabilisees par des interactions de type electrostatique. Comme le montrent les etudes effectuees au moyen de la spectroscopie de fluorescence resolue en temps, la mobilite des tryptophanes impliques dans ces structures residuelles est reduite de facon significative par rapport a celle des tryptophanes dans une chaine polypeptidique totalement denaturee. Cette technique permet egalement de montrer qu'au cours de la denaturation, l'environnement du tryptophane 333 est modifie avant celui du tryptophane 308. D'apres les cinetiques de renaturation des mutants, il semble que la formation de ces microstructures corresponde a une initiation du repliement. Ces etudes ont egalement permis de mettre en valeur l'heterogeneite des echantillons correspondant a l'intermediaire hyperfluorescent observe a l'equilibre, due a un echange rapide entre les formes denaturees compactes et totalement denaturees. Ces etudes nous ont conduit a la conclusion que le repliement peut etre amorce par plusieurs etats conformationnels, meme si le chemin de repliement correspond par la suite a un processus sequentiel