Abstract FR:

Chez les plantes de type c#4, la phosphoenolpyruvate carboxylase (ec 4. 1. 1. 31, pepc) catalyse la fixation photosynthetique primaire du co#2 dans les cellules du mesophylle. Son activite est soumise a deux niveaux de controle: i) metabolique, par des metabolites photosynthetiques (l-malate, retro-inhibiteur ; glucose 6-p et trioses-p, activateurs allosteriques), ii) covalent par phosphorylation d'une serine du domaine n-terminal (n 8 chez le sorgho). Une etude generale des relations structure/fonction de la pepc-c#4 a ete entreprise afin de preciser les bases moleculaires de la regulation covalente. La mutagenese dirigee a permis de modifier certains acides amines consensus du site de phosphorylation de la pepc-c#4 recombinante de sorgho. L'introduction d'une charge negative en position 8, le remplacement de la proline 18 par une alanine ou l'interaction de la proteine sauvage avec un anticorps specifique du site de phosphorylation, modifient la sensibilite au l-malate de la pepc de facon similaire a la phosphorylation. Par ailleurs, une pepc-kinase de feuilles de mais partiellement purifiee phosphoryle une threonine, mais non une tyrosine, substituees a la serine 8. Le couple acide-base consensus (glutamate4-arginine5) est implique dans la reconnaissance de la pepc par la proteine-kinase. Enfin la cristallisation de la pepc-c#4 a debute et les premiers cristaux ont ete obtenus. Differentes techniques de purification ont ete developpees afin de caracteriser la pepc-kinase (pepc-k) responsable de la phosphorylation de la pepc in vivo. Apres purification partielle, deux types d'activite pepc-k sont mesurees dans les extraits proteiques: bk dependante du magnesium et de l'atp, et cdpk necessitant de plus la presence du calcium. Selon la technique utilisee, les proportions relatives des deux types de pepc-k varient, et la cdpk semble etre co-purifiee avec la pepc. Les deux enzymes phosphorylent la proteine cible sur la serine regulatrice et sont toutes deux presentes dans les cellules de mesophylle, ce qui rend l'authentification de la pepc-k physiologique difficile. D'autre part, l'utilisation des protoplastes de cellules de mesophylle de sorgho a permis d'etablir que le calcium et l'alcalinisation du ph cytosolique sont des elements de la chaine de transduction du signal lumineux conduisant a la phosphorylation de la pepc. Nous avons etudie les proprietes de la pepc-c#4 in vitro, dans des milieux reconstitues simulant l'environnement de l'enzyme dans le cytoplasme de cellules de mesophylle. Combines, la phosphorylation et le glucose 6-phosphate, a ph 7,3, augmente fortement la valeur d'ic#5#0 pour le malate de la pepc (15 mm), permettant ainsi a l'enzyme de fonctionner en presence de fortes concentrations en son retro-inhibiteur. Ces metabolites controlent egalement la vitesse de phosphorylation de la pepc. Ainsi, l'activite de la pepc-c#4 resulterait in vivo, de l'interaction reciproque entre les regulations covalente et metabolique. In vitro, la pepc-c#3 racinaire recombinante est phosphorylee par les pepc-kinases de feuilles et de racines, et par la sous-unite catalytique de la proteine-kinase dependante de l'ampc de buf sur le site n-terminal regulateur. L'activite de la pepc-kinase racinaire varie en fonction de l'alimentation azotee et devient maximale lorsque les plantes carencees en azote sont realimentees en ions ammoniums. Il semble donc que cette forme de pepc-c#3 pourrait etre regulee par phosphorylation, contribuant ainsi a la coordination des metabolismes carbone et azote dans la racine de sorgho