Abstract FR:

Chez le sorgho, la malate deshydrogenase a nadp (mdh a nadp, ec 1. 1. 1. 82) est un enzyme clé de la voie d'incorporation du co#2 atmosphérique. Le sujet de cette thèse a consisté à étudier son site actif par mutagenese dirigée et par dérivation chimique. Le site de fixation du nadph a été étudié par une approche chimique en utilisant des analogues arylazido-aminobutyryl du cofacteur. Les expériences réalisées ont montré que ces analogues sont des inhibiteurs compétitifs du nadph et que, après une forte irradiation, ils se fixent de façon covalente au site du cofacteur. Des expériences préliminaires de localisation de ce site de fixation ont été réalisées. L'effet du diethylpyrocarbonate (depc) a été testé sur l'activité de la mdh a nadp de sorgho. Les résultats obtenus montrent qu'une histidine est localisée au site actif cet enzyme. Apres coupure trypsique de la protéine traitée au depc, des analyses par séquençage et par spectrométrie de masse ont permis d'identifier l'histidine dérivée (his229). Afin de préciser le rôle de ce résidu dans l'activité de l'enzyme, il a été remplace par mutagenèse dirigée. Les protéines mutées sont totalement inactives démontrant que l'his229 joue un rôle primordial dans la catalyse de la mdh a nadp de sorgho. Une interaction de l'histidine du site actif avec un aspartate ayant été suggérée par analogie avec les mdh a nad, le résidu candidat a ce rôle (asp201) a été remplace par une alanine ou une asparagine. Les protéines mutées ont des paramètres cinétiques fortement modifies, indiquant que l'asp201 participe a la catalyse en interaction avec l'his229. Par ailleurs, il avait été propose que la cystéine 175 forme une triade catalytique avec l'his229 et l'asp201. Une mdh mutée dans laquelle la cys175 a été remplacée par une alanine a donc été produite, mais elle présente des paramètres cinétiques peu différents de ceux de l'enzyme non mute, ce qui indique que ce résidu ne participe pas à la catalyse