Abstract FR:

Le premier chapitre est consacre a l'expression du recepteur muscarinique m2 humain dans trois lignees cellulaires d'insecte en utilisant le baculovirus comme systeme d'expression. Nous avons montre que le recepteur recombinant est exprime a 2-3 pmoles/mg de proteine dans les cellules sf9. Afin d'optimiser le taux d'expression, nous avons egalement produit le recepteur dans les cellules sf21 et high5. L'immunodetection du recepteur a clairement montre que la proteine recombinante est proteolysee dans les cellules sf9 et high5. Le recepteur m2 recombinant est fonctionnel, meme s'il n'est pas couple aux proteines g endogenes. Nous avons egalement analyse les proteines g endogenes presentes dans les cellules sf9 en utilisant une combinaison d'immunodetection et d'adp-ribosylation. La seconde partie de ce memoire concerne l'etude par mutagenese dirigee du site de liaison du recepteur muscarinique m2. Nous avons pris le modele decrit par hibert et al. (1991) pour cibler les residus a muter. Dans ce modele, l'acetylcholine se fixe dans une poche hydrophobe au cur des 7 helices transmembranaires. Le groupement amine de l'acetylcholine forme une liaison ionique avec l'aspartate d103. Cette interaction est fortement stabilisee par des interactions de type hydrophobe avec les residus aromatiques w99, w155, w400 et y403. En outre, il apparait que la partie non basique de l'acetylcholine peut former une liaison hydrogene avec les residus asparagine q179, t187, t190 ou n404. Nous avons mute tous ces residus en alanine. Nos resultats demontrent le role crucial des residus d103, y403 et n404 dans la liaison des ligands muscariniques: leur mutation en alanine induit une perte totale de liaison specifique. La mutation en alanine des deux residus threonine induit une perte d'affinite pour la plupart des agonistes testes, les antagonistes n'etant pas affectes. La mutation q179a ne change pas les caracteristiques pharmacologiques du recepteur m2. Nous avons montre que les recepteurs w155a et w400a lient les ligands muscariniques avec une forte perte d'affinite. Au contraire, la mutation en alanine du residu w99 n'affecte que la liaison de la methoctramine. Afin de determiner si la perte de liaison specifique est due a l'alteration du site de liaison et non a une absence d'expression, nous avons decide d'introduire dans la partie n-terminale du recepteur la sequence flag (dykddddk). Des experiences d'immunofluorescence nous ont permis de montrer que tous les recepteurs mutants sont exprimes a la surface cellulaire