Abstract FR:

Le sujet de ma these a ete l'etude des mecanismes moleculaires de la determination des cellules souches hematopoietiques pluripotentes. Pour etudier le role de molecules regulatrices (facteurs de croissance et leurs recepteurs, facteurs de transcription ou encore elements de la transmission des signaux de transduction) sur la determination des cellules souches, leurs sequences codantes ont ete introduites, par infection retrovirale, dans des cellules pluripotentes hematopoietiques murines et humaines. Les consequences possibles de cette manipulation genetique ont ete etudiees. Dans une premiere partie du travail, la reconstitution clonale de l'hematopoiese d'une souris irradiee a ete mise au point. En effet, seule une reconstitution clonale permettrait de comprendre les consequences de l'expression d'un transgene sur le devenir a long terme d'une cellule souche. Pour realiser cet abord, nous avons tire partie des proprietes des cfu-s de souris traitees au 5-fu a reconstituer l'hematopoiese de souris irradiees a dose letale. Cependant, il a ete montre dans le laboratoire que dans les protocoles d'infection retrovirale, les cfu-s venant de souris traitees au 5-fu perdent leur propriete de reconstituer l'hematopoiese de souris irradiees a dose letale. Nous avons teste differentes conditions d'infection retrovirale permettant le maintien des proprietes des cellules souches. En particulier, les lignees productrices de retrovirus recombinants classiques ont ete remplacees par des cellules stromales murines competentes pour le maintien de l'hematopoiese (ms-5). L'infection retrovirale des cellules hematopoietiques pluripotentes realisee en presence de cellules ms-5 et de surnageant retroviral permet d'infecter efficacement les cfu-s et de maintenir leur propriete de reconstituer l'hematopoiese de souris irradiees a dose letale. Malheureusement, lorsqu'une seule cfu-s est greffee, elle n'est capable de reconstituer l'hematopoiese qu'a court terme et l'hematopoiese a long te rme est assuree par des cellules souches endogenes ayant resiste a l'irradiation. Dans la seconde partie de mon travail de these, les sequences codantes du recepteur de l'erythropoietine (r-epo) et du recepteur de la thrombopoietine (c-mpl) ont ete transferees dans des cellules hematopoietiques pluripotentes murines et humaines et les consequences de l'expression constitutive de ces recepteurs ont ete etudiees sur leur determination, proliferation et/ou differenciation. Nous avons montre qu'in vitro les progeniteurs pluripotents murins exprimant constitutivement r-epo ou c-mpl : (1) proliferent en reponse a l'erythropoietine (epo) ou a la thrombopoietine (tpo) seule ; (2) ne s'engagent pas preferentiellement vers la differenciation erythroblastique ou megacaryocytaire et (3) peuvent se differencier en cellules erythroblastiques et megacaryocytaires matures mais ne peuvent se differencier en cellules granulo-macrophagiques matures a l'echelle unicellulaire. In vivo, l'hematopoiese de souris irradiees a dose letale greffees avec des cellules souches exprimant constitutivement c-mpl, a court terme et a long terme, est identique a celle de souris greffees avec des cellules souches exprimant constitutivement un gene temoin. Dans la derniere partie du travail, nous avons developpe des modeles cellulaires pour etudier les mecanismes moleculaires de la determination et de la differenciation de cellules pluripotentes. La sequence codante de c-mpl a ete transferee dans deux lignees continues humaines pluripotentes de phenotype erythroblastique et megacaryocytaire, tf-1 et ut-7. Les cellules tf-1 et ut-7 exprimant constitutivement c-mpl proliferent en reponse a la tpo. De plus, la tpo inhibe la differenciation erythroblastique induite par l'epo. Par ailleurs, la tpo induit la differenciation megacaryocytaire uniquement dans les cellules ut-7/c-mpl. Les mecanismes moleculaires de ce phenomene sont en cours d'exploration et les premiers resultats suggerent que l'inhibition de la differenciation erythroblastique induite par la tpo dans les cellules tf-1/c-mpl serait liee a une regulation negative de gata-1. Les effets de la tpo ressemblent a ceux des esters de phorbol (activateurs de la pkc) qui d'une part inhibent la differenciation erythroblastique et d'autre part induisent la differenciation megacaryocytaire. Nous avons montre que des inhibiteurs de la pkc ne modifient pas l'action de la tpo sur les cellules ut-7/c-mpl ce qui suggere que l'action de la tpo ne serait pas mediee par l'activation de la pkc.