Abstract FR:

Les déficits en pyruvate désydrogénase (PDH) constituent une des premières causes d'hyperlactatémie primaire chez les enfants atteints de maladies neurologiques mitochondriales. Un blocage de cette enzyme entraîne une élévation parallèle de la lactatémie et de la pyruvicémie (et du lactate et pyruvate dans le liquide céphalo-rachidien), avec un rapport lactate/pyruvate normal. Ces dosages simples sont le point de départ biologique de la recherche de déficit en PDH pour tous les patients et la majorité des patientes. Nous présentons dans la première partie de ce travail les résultats obtenus au laboratoire pour une cohorte de 30 patients. Dix-huit d'entre eux présentaient un anomalie au niveau du gène PDHA1(Xp22. 1-Xp22. 2), quatre au niveau du gène PDHX (11p13). Pour un patient, nous avons diagnostiqué un déficit en E3 (7p31. 1-7q32), sous-unité commune à trois déshydrogénases mitochondriales dont la PDH. Pour sept patients, nous n'avons pas identifié d'anomalie moléculaire malgré des signes clinico-biologiques trés évocateurs. Ces données sont discutées et comparées à celles de la littérature. Une proposition de conduite à tenir pour le diagnostic, en fonction des nouveaux outils d'analyse enzymatique et moléculaire que nous avons développés. Sera développée à la fin du document. Dans la seconde partie, nous détaillons les investigations moléculaires plus approfondies des déficits en PDH. Nous présentons la mise en place d'outils préliminaires qui permettront l'étude de la fonctionnalité des nouvelles mutations faux-sens chez S. Cerevisiae. Nous revenons en détail sur la détection de deux délétions intragéniques (sur les gènes PDHA1 et PDH X), sur l'étude d'un mosaïcisme somatique chez un garçon présentant une mutation au niveau du gène PDHA1 et sur deux mutations entraînant une dégradation de l'ARNm par le mécanisme de "Nonsense mRNA mediated Decay" (gènes PDHA1 et E3BP). Nous terminons par un récapitulatif des anomalies d'épissage. Dans la dernière partie, nous étudions le mécanisme moléculaire d'une mutation ponctuelle intronique sur la séquence du gène PGHA1, conduisant à une rétention partielle d'un intron au niveau de l'ARNm. Nous montrons par épissage in vitro que cette mutation intronique (IVS7+26G>A)entraîne l'utilisation d'un site cryptique d'épissage, "GT" en position 46 et 47 de l'intron 7. Ainsi que l'avait prédit le programme "ESE finder", nous montrons par UV-crosslinking que la protéine SC35, facteur d'épissage de la famille des protéines SR, se fixe avec une plus grande affinité sur la séquence intronique mutée G>A (ESE), entraînant ainsi une utilisation préférentielle du site donneur cryptique. Nous montrons enfin, qu'une déplétion en SC35 (obtenue par l'utilisation de SiRNA) sur les fibroblastes du patient entraîne une disparition de l'ARNm anormalement épissé. Ce travail démontre l'implication de l'interaction SC35/ESE et le rôle des séquences introniques en pathologie humaine. De plus, il ouvre de nombreuses voies de recherche au niveau de la thérapie des anomalies d'épissage.