Structure, fonction et mécanisme d'assemblage en fibres du prion de levure Ure2p
Institution:
Paris 11Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
The [URE3] non-Mendelian element of the yeast Saccharomyces cerevisiae is due to the propagation of an "infectious" form of the protein Ure2. The infectivity is thought to originate from a conformational change of the normal form of the prion protein. We expressed Ure2p in Escherichia coli and demonstrated that the N-terminal region of the protein is flexible and unstructured, while its C-terminal region is compactly folded. We determined that the oligomeric state in solution of Ure2p is mainly dimeric. We show that in vitro, the protein spontaneously forms long, straight, insoluble protein fibrils at neutral pH. We identify that pH-induced conformational changes direct Ure2p assembly into fibrils. We solved the crystal structure of the functional domain of Ure2p extending from the residue 95 to 354. We showed that Ure2p has a fold similar to that of glutathione S-transferases (GSTs). We determined the ability for Ure2p to bind glutathion, and solved the crystal structure of complexes of Ure2p with GSH and various analogues. We showed that fibrils of intact Ure2p assembled in vitro do not possess the cross beta-structure of amyloid, but instead are formed by the polymerization of native-like helical subunits. We showed that dissociation of the normally dimeric protein to its constituent monomers is a prerequisite for assembly into fibrils. By analysing the nature of early assembly intermediaites, as well as fully assembled Ure2p fibrils using atomic force microscopy, and combining the results with experiments that probe the fidelity of the native fold in protein fibrils, we present a model for fibril formation, based on assembly of native-like monomers, driven by interactions between the N-terminal glutamine and asparagine-rich region and the C-terminal functional domain. The results provide a rationale for the effect of mutagenesis on prion formation and new insights into the mechanism by which this, and possibly other inheritable factors, can be propagated.
Abstract FR:
Un certain nombre de maladies neurodégénératives sont dues à une protéine cellulaire dans une conformation transmissible. Cette protéine est appelée prion. Deux protéines de la levure Saccharomyces cerevisiae subissent une transformation transmissible. Nous avons cherché à documenter les mécanismes moléculaires à l'origine de l'apparition et la propagation des prions en étudiant la protéine Ure2. Nous avons montré par protéolyse ménagée que Ure2p est constituée de deux parties: le N-terminal peu structuré, le C-terminal fortement structuré. Nous avons documenté l'état d'oligomérisation de Ure2p en montrant que la protéine est principalement dimérique en solution. Nous avons trouvé des conditions où Ure2p s'assemble en fibres in vitro. Nous avons caractérisé ces fibres et montré que l'étape limitante dans l'assemblage de Ure2p est l'étape de nucléation. Nous avons mis en évidence un intermédiaire de repliement pH-dépendant et déterminé que la forme monomérique de Ure2p est le précurseur des fibres. Nous avons caractérisé la structure cristallographique de Ure2p correspondant aux 3/4 de la protéine (résidus 95 à 354). Nous avons ainsi pu démontrer la forte homologie structurale de Ure2p avec les gluthation-S-transférases. Nous avons ensuite caractérisé l'interaction de Ure2p avec un de ses ligands, le glutathion, en mesurant ses constantes de dissociation et en déterminant la structure cristallographique du complexe protéine-ligand. Nous avons documenté la structure de Ure2p dans les fibres par diffraction des rayons X par les fibres, la spectroscopie infrarouge et la protéolyse ménagée. La comparaison de la structure de la forme soluble de Ure2p à celle de la protéine dans les fibres nous révèle que les fibres sont hautement hélicales, et qu'il ne s'agit par conséquent pas de fibres amyloi͏̈des. Ces résultats fournissent de nouvelles bases pour la compréhension des mécanismes moléculaires à l'origine de l'apparition et de la propagation des prions.