Abstract FR:

Ce travail de thèse est centré sur l'étude in situ de métalloprotéines par, d'une part, des mesures de spectroscopie d'absorption X effectuées avec contrôle électrochimique ou sous haute pression, et d'autre part des mesures de spectroscopie IR sous haute pression. L'absorption X peut donner des informations détaillées sur l'environnement et la structure électronique du métal présent au site actif. Le potentiel électrochimique permet le contrôle de l'état redox du métal. La pression agit sur les structures secondaire, tertiaire et éventuellement quaternaire des protéines. Pour ce qui concerne la partie électrochimie, nous avons développé, en collaboration avec une équipe de l'Université de Camerino en Italie, deux cellules couplées à une station de travail électrochimique pour faire des mesures d'absorption X sous contrôle électrochimique. La première cellule est adaptée aux échantillons en solution. La deuxième cellule est adaptée aux poudres hydratées et apporte des possibilités nouvelles. Son électrode de travail, en particulier, est une évolution par rapport aux électrodes de type RVC décrites dans la littérature ; elle est caractérisée par une très grande surface spécifique qui facilite le contact protéine-électrode. Cette électrode permet de s'affranchir de manière simple et efficace des problèmes liés aux transferts de charges pour une protéine. Ses avantages sont les suivants : possibilité de travailler avec quelques milligrammes de protéine ; très bon rapport signal sur bruit dans le spectre d'absorption X avec possibilité, dans le cas de sources synchrotron de 3ème génération (ESRF, SOLEIL) d'utiliser des concentrations plus faibles; possibilité d'effectuer toutes les expériences électrochimiques et de faire des cinétiques sur la protéine; facilité et simplicité de montage et reproductibilité du dispositif (électrode, cellule, mise en place sur la ligne de lumière synchrotron). Nous avons pu montrer l'efficacité de cette cellule avec une procédure d'analyse originale, en montrant qu'il est possible de calculer un voltabsorptogramme avec les données d'absorption X. Ceci a été montré pour un système biomimétique (MP-11) et surtout pour une protéine, la Superoxyde Dismutase (CuZn SOD). Les expériences sous pression ont été réalisées sur la CuZn SOD. Nous avons effectué des expériences d'absorption X avec détection de fluorescence sur de la protéine comprimée dans la presse gros volume Paris-Edimbourg du LURE. Nous avons également adapté une cellule à enclume de diamants pour faire des expériences de spectroscopie IR sous pression sur des échantillons de la protéine sous différentes formes, dont des monocristaux. Cette partie du travail a été faite en collaboration avec le Laboratoire de Physique des Milieux Condensés de l'Université Paris 6, et en utilisant le montage infrarouge MIRAGE du LURE. Les mesures d'absorption X ont permis de déceler un changement structural induit par la pression, qui affecte notamment l'environnement de l'ion Cu du site actif. Nos diverses expériences montrent que la CuZn SOD, bien que dimérique, supporte sans se dénaturer des pressions exceptionnellement élevées et que les cristaux restent intacts au-delà de 10 kbars.