Mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la différenciation des cellules de neuroblastome en réponse à l'acide rétinoïque et au trioxyde d'arsenic
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Abstract EN:
Neuroblastoma is the most common extracranial childhood cancer, which can regress or differentiate spontaneously into ganglioneuroma in some patients. To understand and reproduce this spontaneous differentiation is therefore a potentially valuable therapeutic approach to improve the prognosis of patients. Our study focused on the comparison of the mechanisms involved in the differentiation of neuroblastoma cells in response to As2O3 or ATRA (both known to induce in vitro differentiation of neuroblastoma cell into neurons), in 3 human cell lines with different cytogenetic characteristics: the SH-SY5Y, IGR-N-91 and LAN-1 cell lines. We first confirmed the induction of morphological differentiation (neuritogenesis) in neuroblastoma cells in response to ATRA and As2O3 used at concentrations under 2 micromolar, higher doses inducing apoptosis. We have, in parallel, confirmed this early stage of differentiation with protein markers: β3-tubulin and neurofilament isoforms. In response to As2O3, we observed an activation of the ERK pathway required for neuritogenesis, and an increase in body size of nuclear structures called PML-NBs (promyelocytic leukemia nuclear bodies) within two of the three cell lines (SH-SY5Y and IGR-N-91). Treatments also induced the activation of the PI3K/Akt pathway, which did not seem necessary for the differentiation of neuroblastoma. Finally, we have also demonstrated the involvement of reactive oxygen species in this process, although their exact role remains to be defined. We next explored the role of PML in neuroblastoma differentiation, by either stimulating its expression with gamma interferon, or by inhibiting its expression using shRNA transduction. In SH-SY5Y and LAN-1 cell lines, PML appears to be essential for the differentiation induced by As2O3. In response to ATRA, similar mechanisms were observed in SHSY5Y, but PML did not seem necessary for the induction of the early stages of differentiation in LAN-1. These results led us to test the effects of a combination of low, nondifferentiating doses of As2O3 and ATRA, which allowed to induce neuritogenesis in neuroblastoma in a PML-dependent manner in SH-SY5Y but not in LAN-1 cell lines. In conclusion, our study has provided insight into the mechanisms involved in the differentiation of neuroblastoma cells in response to As2O3 and ATRA. Our results will open perspectives for considering the use of a combination of these agents for neuroblastoma treatment, in order to overcome treatment resistance problems, and to limit their side effects in young patients.
Abstract FR:
Le neuroblastome est le cancer extra-crânien le plus fréquent chez l’enfant, et présente la particularité, chez certains patients, de régresser ou se différencier spontanément en ganglioneurome. Comprendre et reproduire cette différenciation spontanée constitue donc une approche thérapeutique potentiellement intéressante pour améliorer le pronostic des patients. Notre étude a porté sur la comparaison des mécanismes impliqués dans la différenciation des cellules de neuroblastome en réponse au trioxyde d’arsenic (As2O3) ou à l’ATRA [(all trans retinoic acid) (deux molécules connues pour induire la différenciation des cellules de neuroblastome en neurones ex vivo)], et ce dans 3 lignées cellulaires humaines présentant des caractéristiques cytogénétiques différentes : les lignées SH-SY5Y, IGR-N-91 et LAN-1. Nous avons dans un premier temps confirmé l’induction de la différenciation morphologique (neuritogenèse) des cellules de neuroblastome en réponse à l’ATRA et à une faible dose d’As2O3, une forte dose induisant l’apoptose. Nous avons, en parallèle, confirmé cette phase précoce de différenciation par des marqueurs protéiques : la tubuline β-3 et les neurofilaments de faible et moyen poids moléculaire. En réponse à l’As2O3, nous avons observé une activation de la voie ERK, nécessaire à la neuritogenèse ainsi qu’une augmentaton en taille de structures nucléaires appelées PML-NB (promyelocytic leukemia nuclear bodies) dans deux des trois lignées cellulaires (SH-SY5Y et IGR-N-91). La voie PI3K/Akt, bien qu’activée à la fois par l’As2O3 et l’ATRA, ne semble pas nécessaire à la différenciation des neuroblastomes. Enfin, nous avons également mis en évidence une implication des espèces radicalaires oxygénées dans ce processus, bien que leur rôle exact reste à définir. Nous avons ensuite exploré le rôle de PML dans la différenciation des neuroblastomes, soit en stimulant son expression par l’interféron gamma, soit en l’inhibant par la transduction de shRNA. Dans les lignées SH-SY5Y et les LAN-1, PML apparait comme indispensable à la différenciation induite par l’As2O3. En réponse à l’ATRA, des mécanismes similaires sont observés chez les SHSY5Y, mais PML ne semble pas nécessaire à l’induction des phases précoces de la différenciation dans les LAN-1. Ces résultats nous ont conduits à tester les effets d’une association de faibles doses non différenciantes d’As2O3 et d’ATRA, qui permet d’induire la neuritogenèse des neuroblastomes d’une façon dépendante de PML dans les SHSY5Y mais pas dans les LAN-1. En conclusion, notre étude a permis de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la différenciation des cellules de neuroblastome en réponse à l’As2O3 et à l’ATRA, permettant d’envisager à long terme l’utilisation de ces deux molécules en association pour la prise en charge des neuroblastomes, afin de s’affranchir des problèmes de résistance à ces traitements, et de pouvoir limiter leurs effets secondaires chez de jeunes patients.