Etudes structurales et fonctionnelles d’enzymes du métabolisme de la laminarine de deux organismes modèles émergeants, l’algue brune Ectocarpus siliculosus et la bactérie marine Zobellia galactanivorans
Institution:
Paris 6Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Laminarin is a storage polysaccharide found in brown algae. Ectocarpus siliculosus has been recently established as a genetic and genomic model for brown algae. The analysis of its genome sequence revealed some candidate genes involved in the central metabolism of laminarin. In order to go onto functional studies, I have applied a medium throughput cloning strategy on these genes. Brown algae being an important coastal biomass, laminarin is also a significant carbon source for marine heterotrophic bacteria. The marine bacterium Zobellia galactanivorans is currently being established as a model bacterium for the bioconversion of algal polysaccharides. Its genome sequence encodes 5 putative laminarinases displaying various modular architectures. The heterologous expression and the purification of the catalytic modules ZgLamAGH16, ZgLamCGH16 and those of the carbohydrate-binding module CBM6 appended to ZgLamCCBM6, have enabled their biochemical characterization. Inactive mutants of the catalytic modules were obtained by site directed mutagenesis. They were used to generate enzyme-substrate complexes. The 3D-structure of ZgLamAGH16 was solved by X-ray crystallography, and oligoglucans of natural substrates were present in the catalytic site. ZgLamCGH16 was obtained in complex with a thio-hexasaccharide of β-1,3-glucan. The ZgLamCCBM6 structure associated with microcalorimetry experiments suggests that this CBM6 can bind laminarin simultaneously in its two binding clefts. The whole results are discussed and integrated in a biologic and evolutive context
Abstract FR:
La laminarine est le polysaccharide de stockage des algues brunes. Récemment, Ectocarpus siliculosus a été développée comme modèle génétique et génomique des algues brunes. L’analyse de son génome a mis en évidence des gènes candidats impliqués dans le métabolisme central de la laminarine. Afin de réaliser des études fonctionnelles, une stratégie de clonage en moyen débit a été appliquée sur ces différents gènes. Les algues brunes étant une biomasse importante, la laminarine est une source de carbone considérable pour les bactéries marines hétérotrophes. La bactérie marine Zobellia galactanivorans devient actuellement un modèle pour la bioconversion des polysaccharides d’algues. L’annotation de son génome a révélé la présence de 5 laminarinases putatives présentant des architectures modulaires variées. L‘expression hétérologue et la purification des modules catalytiques ZgLamAGH16, ZgLamCGH16, ainsi que celle du CBM6 associé à ZgLamCGH16, ont permis leur caractérisation biochimique. Des mutants inactifs des modules catalytiques ont été obtenus par mutagénèse dirigée, permettant l’obtention de complexes enzymes-substrats. C’est ainsi que la structure 3D de ZgLamAGH16 contient des oligosaccharides de substrats naturels tandis que celle de ZglamCGH16 a été obtenue en complexe avec un thio-hexasaccharide de β-1,3-glucane. L’obtention de la structure de ZgLamCCBM6 associée à des expériences de microcalorimétrie suggère que ce CBM6 peut fixer la laminarine dans ses deux sites de fixation simultanément. L’ensemble de ces résultats sont discutés et intégrés dans un contexte biologique et évolutif