Relations structure-séquence-fonction de l'annexine A5 humaine : étude du complexe ternaire : annexine-calcium-phospholipides
Institution:
Paris 11Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Annexins are a family of soluble proteins, which bind in a calcium dependant manner negatively charged membranes. Biological functions of annexins still remain unclear. Numerous structural studies characterized the four homologous domains nature of these proteins, each domain harbours several calcium binding sites. In 1995, an X-ray crystallography study described an interaction involving rat annexin A5, calcium and glycerophosphoserine. However, this model lacks to describe the whole biochemical membrane binding properties of annexins. This work aims to go farther in description of the human annexin A5 -calcium - phospholipids interactions. The site directed mutagenesis method has been chosen for this study, a strategy to which has been associated a NMR approach in order to define the intrinsic affinity of calcium binding sites in solution, and to probe the influence of mutations on these affinities. Several phospholipid binding techniques have been used to probe the implication of crucial residues for membrane binding properties of human annexin A5. This work sheds light on the involvement of each domain of this protein in liposome binding, as well the involvement of the three calcium binding sites located in domain I for its membrane binding properties has been studied. The question of mimicking calcium ions needed for binding by positively charged lysine sidechains has also been addressed in this work. A new phospholipid binding site located in the first or in the second domain of annexins is described. This binding site is compatible with the interaction mode previously described and leads to a multisite binding model of the first domain of human annexin A5. Finally, several conditions have been explored to establish favourable conditions to obtain a NMR high resolution structure of the annexin - calcium -phospholipids complex.
Abstract FR:
Les annexines constituent une famille de protéines solubles, qui lient de façon réversible les membranes chargées négativement en présence de calcium. Les fonctions biologiques précises des annexines restent aujourd'hui encore à déterminer. De nombreuses études structurales ont permis de caractériser la structure modulaire de ces protéines, et notamment les sites multiples de liaison du calcium. En 1995, une étude par cristallographie des rayons X a permis de proposer un modèle d'interaction entre l'annexine A5 de rat, le calcium et la glycérophosphosérine, qui ne rend cependant pas compte de l'ensemble des propriétés biochimiques des annexines. Ce travail a pour objectif de compléter la description des interactions entre annexine A5 humaine et divers phospholipides. La stratégie employée se base sur la mutagenèse dirigée. Cette étude a nécessité la mesure par RMN des faibles affinités des différents sites calcium de la protéine en solution, et de déterminer l'influence des mutations réalisées sur ces affinités. Divers tests de liaison aux phospholipides ont permis de déterminer l'influence des mutations sur l'interaction entre la protéine et différents phospholipides. Ce travail a mis en évidence le rôle des quatre domaines de l'annexine A5 humaine dans le processus de liaison aux liposomes, ainsi que le rôle des trois sites calcium du domaine I dans la liaison et la capacité à mimer les ions calcium par la charge positive d'un résidu lysine. Nous avons proposé un nouveau site phospholipidique présent dans les domaines I ou les domaines II des annexines. Ce site est compatible avec le mode d'interaction décrit dans la littérature, ce qui permet de proposer un mode d'interaction entre un domaine d'annexine et plusieurs phospholipides simultanément. Enfin, nous avons exploré par RMN l'interaction entre le domaine I de l'annexine A5 et différents systèmes phospholipidiques pour établir les conditions favorables à l'étude du complexe annexine-calcium-phospholipides.