Abstract FR:

La bactérie Pseudomonas putida mt-2 est capable d'utiliser le toluène ou le xylène comme unique source de carbone, grâce aux gènes xyl, responsables du catabolisme des hydrocarbures aromatiques. La catéchol 2,3-dioxygénase (XylE) catalyse le clivage oxygénolytique du cycle aromatique. XylE est une enzyme instable qui est inactivée par le 4-méthylcatéchol formé lors de la dégradation du p-xylène et du p-toluate. Des travaux antérieurs ont montré que la protéine XylT, codée par le gène xylT, serait à l'origine d'un mécanisme de réactivation ou de stabilisation de la catéchol 2,3-dioxygénase in vivo. Au cours de ce travail, nous avons étudié le mécanisme de réactivation de XylE in vitro par des approches biochimiques et spectroscopiques. Les protéines XylT et XylE ont été purifiées et caractérisées. La protéine XylT a été purifiée pour la première fois au cours de cette étude. Il s'agit d'une ferrédoxine (Fd) à centre [2Fe-2S] très originale, dont la séquence en acides aminés lui confère un caractère basique. La dioxygénase XylE purifiée a été inactivée par le 4-méthylcatéchol. L'analyse par RPE a montré que l'inactivation résulte de l'oxydation de l'ion Fe2+ du site actif de l'enzyme. La préparation de XylE inactivée a pu être réactivée in vitro par des quantités catalytiques de XylT en présence d'un réducteur photoactivable. En se basant sur une série d'analyses, et notamment des résultats de RPE de complexes XylE-NO, nous avons conclu que XylT réactive XylE par réduction du Fe3+ en Fe2+ au site actif de l'enzyme. Ainsi, XylT fonctionne comme une activase spécifique de XylE. L'interaction entre XylT et XylE a été étudiée par des expériences de pontage covalent et par la méthode de résonance plasmonique de surface. XylT est indispensable à la croissance sur p-toluate. DANS UN MUTANT XYLT, L'INTRODUCTION DU GENE XYLT EN TRANS RETABLIT DES FACULTES DE CROISSANCE NORMALES. TROIS FD, ANALOGUES DE XYLT, ONT ETE EGALEMENT ETE PURIFIEES. ELLES SONT SIMILAIRES A XYLT ET CAPABLES DE REMPLACER XYLT DANS LA REACTIVATION DE XYLE A LA FOIS IN VIVO ET IN VITRO. LES PROTEINES DE TYPE XYLT APPARAISSENT COMME UNE NOUVELLE SOUS-CLASSE DE FD 2FE-2S DONT LA FONCTION EST LA REACTIVATION DES CATECHOL DIOXYGENASES. LE MECANISME DE REACTIVATION MIS EN EVIDENCE PERMET D'ELARGIR LA GAMME DE SUBSTRATS AROMATIQUES QUE LES BACTERIES PEUVENT METABOLISER