thesis

Biosynthèse de la cystéine et de la méthionine chez le champignon phytopathogène Magnaporthe grisea : Analyse de la méthionine synthase et des enzymes de la voie de transsulfuration

Defense date:

Jan. 1, 2006

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Institution:

Pau

Disciplines:

Biology

Authors:

Directors:

Abstract EN:

Filamentous fungi cause devastating diseases of agricultural crops. Recent studies highlighted a need for sulfur amino acids (methionine and cysteine) in the infectious process. To get insight into the physiological significance of sulfur amino acids biosynthesis in the infectious cycle, we have created null mutants of genes involved in the synthesis of homocysteine, cysteine and methionine by a gene deplacement strategy using a plant pathogenic model, Magnaporthe grisea. To this end the genes encoding cystathionine -synthase (CGS1, direct transsulfuration), methionine synthase and the cystathionine -lyase (CGL, reverse transsulfuration) were targeted. While suppression of the methionine synthase gene led to auxotrophy for methionine, mutants for CGS1 showed only strongly delayed growth, and mutants for CGL were prototroph on minimum medium. When tested on plants, only null mutants for methionine synthase were non pathogenic and the infectious cycle was fully restored upon addition of methionine. In the case of the null mutants for CGS1, the delay in development of disease symptoms was postulated to correspond to metabolic adaptation of the pathogen. This hypothesis was tested by analyzing single null mutants for the CGS2 gene, a homologue of CGS1 in M. Grisea, and for the HCS gene encoding homocystéine synthase which is involved in direct sulphydrylation activity for homocysteine built-up. All the single null mutants were prototroph and non pathogenic on plants. The double null mutant targeting CGS1 and CGS2 showed phenotype similar to the single mutant for CGS1. By contrast, the double mutant line for CGS1 and HCS was auxotroph and its growth was complemented by methionine. Altogether these experiments evidenced the role of the direct transsulfuration pathway in the biosynthesis of homocysteine. Biochemical analysis of the mutant for methionine synthase disclosed metabolite reorientations and molecular adaptation to remove toxic accumulated homocysteine. This compound was degraded through the reverse transsulfuration pathway with accumulation of cystathionine as an intermediate. Pleiotropic effects on glutathione, glutamate, serine and arginine pools resulted from the suppression of the methionine synthase gene. Accumulation of homocysteine led to that of adenosylhomocysteine, a potent inhibitor of the S-adenosylmethionine (SAM) dependent methylases. The built-up of SAM, favored by expression of the fungal SAM-methyltransferase gene, in presence of added methionine was a consequence of the growth restoration. Our analysis led to the finding that the reverse transsulfuration pathway is committed to homocysteine degradation when this toxic compound is in excess. Such interpretation was also confirmed through the accumulated cystathionine measured in the null mutant for CGL1 when grown in the presence of methionine. The integrated analysis of the mutants is a way to decipher the flux of sulfur in the growing pathogenic fungi during the infectious cycle.

Abstract FR:

Les champignons filamenteux pathogènes sont à l'origine de maladies dévastatrices des cultures. Des études récentes suggèrent que les champignons présentent un besoin en composés soufrés pour leur développement sur la plante. La voie de biosynthèse des acides aminés soufrés est complexe et se compose à la fois des enzymes appartenant au métabolisme défini chez les plantes et chez Saccharomyces cerevisiae. Les champignons filamenteux synthétisent le précurseur de la méthionine, l'homocystéine, à partir de cystéine par la voie de transsulfuration directe (modèle plante) mais catalysent également la synthèse de cystéine à partir de l'homocystéine par les enzymes de la voie de transsulfuration inverse (modèle S. Cerevisiae). L'étape finale de biosynthèse de méthionine, catalysée par la méthionine synthase, est commune à tous les organismes. Afin de clarifier le rôle de la biosynthèse de la méthionine dans le processus infectieux, un mutant nul pour le gène de la méthionine synthase a été créé chez Magnaporthe grisea. Ce mutant est auxotrophe pour la méthionine et est incapable de développer des lésions sur feuilles intactes ou blessées. En particulier, ce mutant est incapable de développer les hyphes d'infection nécessaires à la pénétration de la plante. Le processus infectieux est restauré par l'addition de méthionine exogène ou après complémentation par le gène de la méthionine synthase. Les champignons filamenteux pathogènes nécessitent donc une synthèse de novo de méthionine pour initier leur cycle infectieux. L'analyse biochimique des mutants nuls indiquent que l'absence de la méthionine synthase s'accompagne d'une modification profonde des pools de métabolites soufrés. En particulier, les taux de glutathion, de glutamate, de sérine et de lysine chutent pendant que l'homocystéine, le Sadénosylhomocystéine et la cystathionine s'accumulent. Ces résultats indiquent que l'augmentation d'homocystéine est détoxiquée par la voie de transsulfuration inverse mais ne peut aboutir à la conversion en cystéine. D'autre part, ces données suggèrent une inter-régulation entre la biosynthèse de méthionine et celle du glutamate. Chez les champignons filamenteux, la voie de transsulfuration directe est décrite comme la voie majoritaire de synthèse de méthionine. Cette hypothèse a été validée par la création d'un mutant nul pour le gène codant la cystathionine gamma-synthase 1 (CGS1) de M. Grisea. Néanmoins, ce mutant ne présente qu'un fort retard de croissance sur milieu minimum conduisant à une pathogénie retardée et réduite. Ces résultats confortent l'hypothèse d'un besoin de synthèse de méthionine pour l'infection mais indiquent également l'existence d'une (ou plusieurs) voie(s) supplémentaire(s) permettant ce contournement métabolique. Deux gènes peuvent être à l'origine de cette reprise de croissance : un gène codant un homologue de la CGS1, appelé CGS2, et le gène codant l'homocystéine synthase (HCS1), enzyme permettant la sulfhydrylation directe d'une molécule en C4 pour former de l'homocystéine. Les mutants nuls pour les gènes CGS2 et HCS1 sont prototrophes et totalement pathogènes sur plantes. De plus, le double mutant pour les gènes CGS1 et CGS2 présente un phénotype de croissance et une pathogénie similaire à celles du mutant simple cgs1. La CGS2 n'est donc pas impliquée dans le contournement métabolique révélé dans le mutant cgs1. En revanche, le double mutant pour les gènes CGS1 et HCS1 présente un phénotype auxotrophe et l'évaluation du pouvoir pathogène est en cours de réalisation. Toutefois, ces résultats préliminaires démontrent que le contournement métabolique observé chez le mutant pour le gène CGS1 serait le résultat de l'activité de la voie de sulfhydrylation directe catalysée par la protéine HCS1. Au vu du rôle physiologique de la voie directe dans la biosynthèse de la méthionine chez M. Grisea, la voie de transsulfuration inverse a été étudiée. Le mutant nul pour le gène CGL1 codant pour la cystathionine gamma-lyase est prototrophe et pathogène sur plante. Néanmoins, l'analyse biochimique de ce mutant révèle une forte accumulation (40 fois) de cystathionine dans la cellule fongique et suggère un rôle de la voie inverse dans le catabolisme de l'excès d'homocystéine. De plus, le mutant pour la CGL1 présente d'importantes difficultés à sporuler indiquant un rôle de cette voie pour la biosynthèse de cystéine au cours de la sporulation.