Abstract FR:

Une nouvelle strategie pour isoler des mutants thermoconditionnels de l'endocytose chez l'amibe dictyostelium a ete mise au point. Elle repose sur l'emploi de molecules photoactivables dirigees selectivement vers les compartiments endocytaires de l'amibe: le 4',5'-diiodo- et le 2',4',5',7'-tetrabromofluoresceine isothiocyanate-dextran (i2fd et br4fd). L'halogenation du residu fluoresceine affecte severement son rendement quantique de fluorescence mais lui confere des proprietes photodynamiques interessantes: l'illumination de l'i2fd ou du br4fd en solution genere, en presence d'oxygene, de l'oxygene singulet. L'action photodynamique du br4fd est environ trois fois plus efficace dans celle de l'i2fd. Le protocole d'isolement des mutants thermoconditionnels de l'endocytose consiste en une repetition du cycle: incubation a 27c - charge d'i2fd a 27c - illumination - culture a 20c. A chaque etape d'illumination, les cellules parentales gorgees de molecules photoactivables sont tuees alors que les mutants de l'endocytose, qui n'ont pas internalise la sonde a 27c, sont epargnes. Ce tri positif a permis d'isoler 26 lignees cellulaires tsg (thermosensitive for growth thermosensibles de croissance) appelees de hgr101 a hgr126. Ils sont tous affectes dans une etape precoce de la voie endocytaire a la temperature non permissive (27c). La majorite des souches presente un rebond transitoire d'activite endocytaire apres une forte inhibition dans la premiere heure a 27c. Ce rebond n'est plus observe a 29c. Les processus d'entree et de sortie de fluide sont decouples a 27c pour la moitie des souches (phenotype fuyant). L'autre moitie a un phenotype fige a 27c mais fuyant a 29c. La selection de diploides a permis de mettre en evidence 10 mutations independantes qui correspondent a 10 proteines differentes impliquees dans l'endocytose mais qu'il reste a caracteriser